住肉孢子虫（Sarcocystis）属孢子虫纲、真球虫目、肉孢子虫科、孢子虫属，能够感染人和多种动物，是一种重要的人畜共患寄生虫病，通常以马、牛羊、猪等作为中间宿主，食肉动物和人作为终末宿主[1]。住肉孢子虫在中间宿主的横纹肌、心肌等肌肉组织中形成包囊，引起畜禽发病，可对畜禽产品的卫生质量和安全性造成严重影响[2]。人类食用含有包囊虫体的肌肉组织后，能够引起恶心、头疼、腹泻、消瘦、呕吐、贫血等症状[3]，可对人类健康和畜牧业发展构成严重威胁。绵羊是住肉孢子虫的重要中间宿主，绵羊感染住肉孢子虫后可出现食欲下降、消瘦、肌肉炎症、流产、早产等症状，严重者可导致羊死亡[4-5]。辽宁西部地区是辽宁省重要的绵羊产区，在以往的文献中虽然已有绵羊住肉孢子虫流行病学方面的研究[6-8]，但有关绵羊住肉孢子虫的种类及遗传进化关系的研究尚未见报道。本研究旨在阐明该地区绵羊住肉孢子虫的虫体种类以及遗传进化关系，以期为相关研究、诊断与防治工作提供参考。1材料与方法1.1试剂与仪器主要试剂：血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）购自天根生化科技有限公司产品；2×Es Taq Master Mix（Dye）购自康为世纪生物科技有限公司；DL2000 DNA Maker购自宝日医生物技术有限公司；G8140绿色荧光核酸染料（10 000×）、琼脂糖，均购自索莱宝生物科技有限公司。主要仪器：BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、DYY-6C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、T960热循环仪（杭州晶格科学仪器有限公司）、Tanon 2500R全自动数码凝胶图像分体（上海天能科技有限公司）、JB-CJ-2FD超净台（苏州净化工程设备有限公司）、HH-6020恒温水槽（常州万科仪器科技有限公司）、低温高速离心机（长沙英泰仪器有限公司）、BM2000生物显微镜（Olympus）、JE602电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）、Reference移液器（Eppendorf公司）。1.2样品采集辽宁西部地区3个农贸市场随机采集23份新鲜绵羊膈肌样品，标号，放入冰盒内保存并运送至实验室，-20 ℃保存，用于后续显微镜压片镜检和DNA提取。1.3压片镜检法检测将样品剪成麦粒大小，剔除膈肌上的脂肪和筋膜，置于两片载玻片间，将样品压薄制成压片标本。膈肌压片标本厚度为能够清晰看到下面报纸上的字样即可，棉线固定载玻片，置于光学显微镜下观察。每份样品检测15张压片标本，15张压片标本全部阴性者则该份样品标记为阴性，15张压片标本中出现1份或1份以上阳性者则该份样品标记为阳性，统计记录检测结果并拍照留存。1.4镜检疑似阳性样品DNA提取分别研磨显微镜压片镜检法获得的阳性膈肌样品，加适量生理盐水混匀，研磨所得组织液倒入1.5 mL离心管，12 000 r/min离心1 min，弃掉上清，加200 μL磷酸盐缓冲液，振荡至彻底悬浮，加入20 μL蛋白酶K（Proteinase K），56 ℃水浴消化1~3 h直至组织彻底溶解。按照血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒说明书操作方法提取虫体DNA，DNA样品-20 ℃保存。1.5引物合成与目的基因片段扩增根据GenBank所登录的cox1基因序列（登录号：KP263744.1），设计一对特异性扩增引物：上游引物cox1-F：5'GTATGTACGTACTTACGGC3'；下游引物：cox1-R：5'CAGTCAACGGCCTCCGTATT3'。PCR反应体系（20 μL）：模板DNA 5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×Es Taq Master Mix 10 μL、ddH2O 3 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，35个循环；74 ℃ 5 min。将所得PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，通过全自动数码凝胶成像系统进行结果观察和图片保存。切胶回收PCR结果阳性条带，并将回收产物与T载体连接、转化、克隆，将PCR鉴定为阳性的菌液送至生物公司测序。1.6序列同源性比对与遗传进化分析将测序所得序列与GeneBank中收录的绵羊住肉孢子虫分离株pcox1序列信息进行比较分析。以弓形虫（Toxoplasma gondii）为外群，通过MEGA 5.05软件校对序列，保存文件，通过DNASTAR中的MegAlign程序将样品序列及GenBank中已收录的住肉孢子虫cox1序列进行分析，比较其同源性和差异性，生成多重序列对比图；利用MEGA5.05软件，以邻接法（neighbor-joining method）将上述所有序列构建系统发育进化树以分析遗传进化关系。绵羊不同住肉孢子虫分离株的pcox1序列信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.008.T001表1绵羊不同住肉孢子虫分离株的pcox1序列信息Tab.1Sequence information of pcox1 of different Sarcocystis isolates in sheep名称基因登录号Sarcocystis tenella isolate 1cox1KP263744.1Sarcocystis tenella isolate 1cSTcox1MH413045.1Sarcocystis arieticanis isolate 1CSAcox1MH413047.1Sarcocystis arieticanis isolate OS38cox1MK419975.1Sarcocystis gigantea isolate OS7cox1MK420011.1Sarcocystis gigantea isolate AR28cox1MT722969.12结果与分析2.1辽西地区绵羊住肉孢子虫压片镜检法检测结果（见图1）通过压片镜检法检测发现，所采集的23份样品中共有11份样品感染住肉孢子虫，分离率达47.8%。将11株住肉孢子虫阳性样品分别命名并编号为辽西1号~辽西11号（LX1~LX11）。由图1可知，光学显微镜下检测样品压片标本，住肉孢子虫包囊分布于绵羊膈肌的肌纤维间，包囊大多数呈弯曲的长椭圆形或梭形。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.008.F001图1辽西地区绵羊住肉孢子虫压片镜检法检测结果Fig.1Results of compression microscopy in western Liaoning Province2.2辽西地区绵羊住肉孢子虫pcox1扩增产物的琼脂糖电泳分析（见图2）由图2可知，经PCR鉴定，11份阳性样品均成功扩增出约397 bp的片段，与预期片段大小相符，阴性对照无条带，说明成功扩增出目的基因。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.008.F002图2辽西地区绵羊住肉孢子虫pcox1扩增产物的琼脂糖电泳分析Fig.2Agarose electrophoresis analysis of the amplified product of Sarcospora pcox1 in western Liaoning Province注 ： M为DL2000 DNA Marker；1~11为LX1~LX11；12为阴性对照。2.3辽西地区绵羊住肉孢子虫pcox1序列差异性比对（见图3）由图3可知，11株住肉孢子虫间序列同源性较高，同源性为96.2%~100.0%。与GeneBank中收录的2株柔嫩住肉孢子虫分离株（登录号：KP263744.1和MH413045.1）的序列同源性分别为96.2%~99.7%和94.4%~97.9%，与其他4株住肉孢子虫分离株（登录号：MH413047.1、MK419975.1、MK420011.1、MT722969.1）的同源性均小于72.2%，种内差异（0~5.8%）小于种间差异（11.3%~35.5%）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.008.F003图3辽西地区绵羊住肉孢子虫pcox1序列差异性比对Fig.3Alignment of pcox1 sequence differences of sheep Sarcocystis in western Liaoning Province注 ： 1~11为LX1~LX11；12~17为S. arieticanis isolate 1CSA、S. arieticanis isolate OS38、S. gigantea isolate OS7、S. gigantea isolate AR28、S. tenella isolate 1、S. tenella isolate 1cST。同源性分析结果表明，本次分离到的绵羊住肉孢子虫均为柔嫩住肉孢子虫。2.4辽西地区绵羊住肉孢子虫分离株系统发育树（见图4）由图4可知，分离得到的11株住肉孢子虫具有高度相似性，与GenBank中已报道的2个柔嫩住肉孢子虫分离株（S. tenella isolate 1和S. tenella isolate 1cST）属同一分支，并且与GenBank中收录的其他种类住肉孢子虫分支较远。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.008.F004图4辽西地区绵羊住肉孢子虫分离株系统发育树Fig.4Phylogenetic tree of sheep Sarcocystis isolates in western Liaoning Province遗传进化分析结果进一步证实，本试验在辽宁西部地区分离到的绵羊住肉孢子虫均为柔嫩住肉孢子虫。3讨论3.1住肉孢子虫的分离鉴定方法住肉孢子虫的分离鉴定方法主要包括传统的形态学观察和分子生物学检测等。形态学观察主要采用显微镜对肌肉组织压片进行观察鉴定，该方法简单实用，主要应用于住肉孢子虫的初步鉴定，但难以区分住肉孢子虫的具体种类[9]。分子生物学检测方法具有敏感性高、特异性强的特点，是目前应用于住肉孢子虫分离鉴定以及遗传进化分析的主要分子手段[3]，常应用于住肉孢子虫检测的基因，包括5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA和cox1基因；其中cox1基因序列相对保守，故在住肉孢子虫的分类鉴定及遗传进化分析方面被认为是理想的遗传标记[10-11]。目前，国际上广泛认同的应用于住肉孢子虫种类鉴定的分子生物学方法是cox1基因分子生物学信息分析方法[12-15]。3.2住肉孢子虫的虫体种类目前，世界范围内报道的住肉孢子虫的虫体种类超过200种[3]，其中绵羊住肉孢子虫有４种，分别为柔嫩住肉孢子虫（Sarcocystis tenella）、巨型住肉孢子虫（Sarcocystis gigantean）、白羊犬肉孢子虫（Sarcocystis arieticanis）、水母形住肉孢子虫（Sarcocystis medusiformis）。我国报道的绵羊住肉孢子虫主要有3种，分别为柔嫩住肉孢子虫、巨型住肉孢子虫和白羊犬肉孢子虫[10]。3.3辽西地区绵羊住肉孢子虫的分离鉴定本研究采用传统的形态学观察和分子生物学检测方法，开展了辽宁西部地区绵羊住肉孢子虫的虫体种类鉴定和遗传进化分析工作。通过压片镜检法分离到11株住肉孢子虫，虫体包囊分布与膈肌的肌纤维之间，包囊大多数呈弯曲的长椭圆形或梭形，符合住肉孢子虫的形态学特征[12]；PCR检测发现，在11份阳性样品中均扩增出大小约397 bp的片段，与预期片段一致；同源性分析发现，样本分离的绵羊住肉孢子虫与GenBank中的2株柔嫩住肉孢子虫的同源性最高，分别为96.2%~99.7%和94.4%~97.9%；系统进化树分析显示与柔嫩住肉孢子虫位于同一分支。4结论本研究结果表明，试验中从辽宁西部地区分离到的绵羊住肉孢子虫为柔嫩住肉孢子虫。本研究结果可为该地区绵羊住肉孢子虫流行病学研究及诊断与防治工作提供一定参考。