山楂果实富含VC和山楂酸等物质，营养丰富，具有重要的药用价值，但山楂叶大部分被丢弃。研究发现，山楂叶的多酚类物质具有抗氧化、降血脂、降血糖等生物活性[1-4]。目前，已有研究将植物多酚应用在饲料工业中，并取得一定的功效。梁高杨等[5]使用茶多酚饲喂奥尼罗非鱼，结果发现，饲料中添加茶多酚能够提高罗非鱼的免疫性能。蒋磊等[6]研究发现，茶多酚可以提高肉鸡生长性能，改善屠宰性能，提升肌肉品质。黄雅莉等[7]研究发现，饲料中添加茶多酚可以改善三黄鸡的屠宰性能和生长性能。孙廷等[8]研究发现，日粮添加400 mg/kg植物多酚可以提高育肥猪日增重和饲料转化率，改善肌肉品质。陈艾玲等[9]研究发现，饲粮中添加茶多酚能够改善青年种鸽产蛋性能、蛋品质及血清生化指标。植物多酚作为饲料添加剂可以改善动物的生产性能，原因是植物多酚是光合作用的次级代谢产物，含有单萜类，α-蒎烯、牛油、月桂烯等功能活性物质，可以抑制细菌和真菌活动[10]。将植物多酚作为植物源性饲料添加剂，具有嵌入细菌膜、降解膜和引起离子泄漏的潜在能力[11]。本研究以山楂叶为原料，采用超声波辅助提取法，探讨乙醇浓度、超声温度、超声时间、液料比对山楂多酚得率的影响，优化山楂叶多酚的提取工艺，以期为山楂叶多酚在饲料中的应用提供参考。1材料与方法1.1材料与设备1.1.1试验材料山楂叶于10月上旬采自武汉设计工程学院。没食子酸标准品、95%乙醇、福林酚购自国药集团化学试剂有限公司；α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶购自上海研谨生物科技有限公司。1.1.2试验设备HH-4数显恒温水浴锅购自国华电器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司；EL204电子天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；R206B旋转蒸发器购自上海申生科技有限公司。1.2测定指标及方法1.2.1山楂叶预处理山楂叶清净置于干燥箱，60 ℃干燥24 h，粉碎，过50目筛。取适量山楂叶粉于烧杯中，按液料比为5 mL/g加入石油醚，磁力搅拌器上室温搅拌24 h，脱脂脱蜡，静置分层，取洗液旋转蒸发回收上层石油醚，下层加入适量石油醚，二次脱脂脱蜡，山楂叶粉干燥储藏[12]。1.2.2山楂叶多酚提取工艺研究1.2.2.1液料比对山楂叶多酚得率的影响精确称取山楂叶粉2 g，超声温度（D）50 ℃、乙醇浓度（A）60%、液料比（B）分别为30、40、50、60、70 mL/g条件下超声时间（C）处理15 min，过滤，收集滤液，考察液料比对山楂叶多酚得率的影响。1.2.2.2乙醇浓度对山楂叶多酚得率的影响精确称取山楂叶粉2 g，液料比为40 mL/g、超声温度为50 ℃条件下，分别使用40%、50%、60%、70%、80%浓度的乙醇溶液超声提取15 min，过滤，收集滤液[13]，考察乙醇浓度对山楂叶多酚得率的影响。1.2.2.3超声时间对山楂叶多酚得率的影响精确称取山楂叶粉2 g，液料比为40 mL/g、乙醇浓度为60%、超声温度为50 ℃条件下、分别超声10、15、20、25、30 min，过滤，收集滤液，考察超声时间对山楂叶多酚得率的影响。1.2.2.4超声温度对山楂叶多酚得率的影响精确称取山楂叶粉2 g，液料比为40 mL/g、乙醇浓度为60%、超声温度分别为45、50、55、60、65 ℃的条件下，超声处理15 min，过滤，收集滤液，考察超声温度对山楂叶多酚得率的影响。1.2.2.5响应面试验设计单因素试验结果的基础上进行Box-Behnken试验设计，响应面试验设计见表1[14]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.T001表1响应面试验设计水平A/%B/(mL/g)C/minD/℃-15040∶1155006050∶1205517060∶125601.2.2.6多酚得率测定以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu比色法（FC法）测定多酚含量[15-16]。绘制的标准曲线回归方程为Y=0.132x+0.033，R2=0.998 2，线性关系良好。样品中总酚含量以毫升样品的没食子酸当量(mg)表示。计算山楂叶多酚得率。山楂叶提取液多酚得率=(C×N×V×103/W)×10000 (1)式中：C为测定液多酚质量浓度（g/L）；N为稀释倍数；V为提取液体积（mL）；W为山楂叶干粉末质量（g）。1.2.3山楂叶多酚体外降糖效果研究1.2.3.1山楂叶多酚对α-葡萄糖苷酶抑制作用研究参照安品弟等[17]方法进行检测，在2 mL、67 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH值6.8）中，加入α-葡萄糖苷酶溶液50 μL，1 g/L还原型谷胱甘肽50 μL，37 ℃保温10 min，分别加入500 μL不同浓度的多酚提取液和20 mmol/L PNPG 30 μL，37 ℃反应10 mm，加入0.1 mol/L Na2CO3溶液10 mL，终止反应，于波长为400 nm处测定吸光度，参照此方法以阿卡波糖代替多酚溶液作为抑制效果对照。按照如下公式进行计算：α-葡萄糖苷酶抑制率=[1-(A样品-A对照)/A空白]×100%(2)式中：A空白为不加山楂叶多酚提取液的酶反应后的吸光度；A样品为加入山楂叶多酚提取液后酶反应的吸光度；A对照为只加山楂叶多酚提取液的吸光度。1.2.3.2山楂叶多酚对α-淀粉酶抑制作用研究参照李井雷等[18]方法进行检测，取0.4 mL的α-淀粉酶（2 U/mL）溶液与0.2 mL不同浓度的多酚提取液在37 ℃预混合10 min，向混合液中加入0.3 mL浓度为5%的淀粉溶液，反应10 min，加入2 mL的DNS试剂（10 g/L 3,5-二硝基水酸和120 g/L酒石酸钾钠溶于0.4 moL/L的氢氧化钠溶液），100 ℃加热15 min终止反应。冷却至室温，540 nm处测量吸光度，参照此方法以阿卡波糖代替多酚溶液作为抑制效果对照[19]。α-淀粉酶抑制率=[1-(A样品-A对照)/A空白]×100%(3)式中：A样品为样品的吸光度；A对照为对照的吸光度；A空白为空白对照的吸光度。1.2.4山楂叶多酚体外抑制胰脂肪酶效果研究1.2.4.1胰脂肪酶活性测定参照段振[20]方法进行检测，取3个100 mL锥形瓶，每瓶加5 mL 0.025 mol/L PBS缓冲液（pH值7.4)和4 mL聚乙烯醇三油酸甘油酯底物乳化液，置于37 ℃培养箱中预热10 min，加入1 mL 2 g/L胰脂肪酶液（以pH值7.4、0.02 mol/L的PBS缓冲液配制），加入胰脂肪酶液保温15 min，加入15 mL 95%乙醇，停止酶反应。加酚酞指示剂3滴，使用0.025 mol/L氢氧化钠标准溶液滴至微红色。同时做空白对照，空白试验不加胰脂肪酶液，保温15 min，加入15 mL 95%乙醇、1 mL胰脂肪酶液，计算胰脂肪酶活力。酶活力(IU)=1 000×V样-V空×ctw (4)式中：c为NaOH标准溶液浓度（mol/L）；V样为样品消耗NaOH标准溶液体积（mL）；V空为对照实验消耗NaOH标准溶液体积（mL）；t为加酶后反应时间（min）；w为胰脂肪酶添加量（g）。1.2.4.2胰脂肪酶抑制率的测定参照杨剑萍等[21]方法，100 mL三角瓶中加入PBS缓冲液及底物乳液，37 ℃恒温培养10 min，分别加入不同浓度的提取液作为胰脂肪酶抑制剂，保温10 min，加入1 mL胰脂肪酶液，静置15 min，加入15 mL 95%乙醇，测定剩余酶活。空白试验不加入提取液。抑制率=(抑制前胰脂酶活力-抑制前胰脂酶活力)/抑制前胰脂酶活力×100%(5)2结果与分析2.1山楂叶多酚提取工艺研究2.1.1液料比对山楂叶多酚得率的影响（见图1）由图1可知，液料比在30~50 mL/g，山楂叶多酚得率呈上升趋势，液料比继续增大，多酚得率呈下降趋势。可能是因为随乙醇用量增加，多酚和乙醇充分接触，使多酚的扩散速率增加，利于多酚的溶出，多酚得率逐渐增大。当液料比为50 mL/g时，多酚得率达最高值0.55%，继续增加乙醇溶剂用量，多酚类物质的溶解逐渐达到饱和，增加液料比会导致其他醇溶类杂质的溶出，山楂叶多酚的得率会下降。因此，选择液料比40、50、60 mL/g作为响应面分析的3个水平较为适宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F001图1液料比对山楂叶多酚得率的影响2.1.2乙醇浓度对山楂叶多酚得率的影响（见图2）由图2可知，随乙醇浓度的增加，多酚得率逐渐增大。当乙醇浓度为60%时，多酚得率最高为0.52%。可能是因为乙醇极性与山楂叶中多酚极性相近，相似相容的原理，使多酚溶出量逐渐增加直至最大。当乙醇浓度大于60%，多酚得率逐渐下降，由于随乙醇体积分数的增加，其他脂溶性物质溶出量增多影响多酚类物质的溶出，导致得率下降[22-23]。因此，选择乙醇浓度50%、60%、70%作为响应面分析的3个水平较为适宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F002图2乙醇浓度对山楂叶多酚得率的影响2.1.3超声时间对山楂叶多酚得率的影响（见图3）由图3可知，随超声时间的增加，山楂叶多酚得率逐渐增加。当超声时间为20 min时，多酚得率达到最大值，为0.53%，随超声时间继续增加，多酚提取量开始下降。可能是由于超声时间延长，超声波的机械作用加速山楂叶细胞壁破裂使乙醇充分和山楂叶中多酚类物质接触，促进多酚溶出，超声时间过长，多酚的氧化分解产物增多、部分多酚在超声波作用下会发生降解使多酚得率下降[24-25]。选择超声时间15、20、25 min作为响应面分析的3个水平较为适宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F003图3超声时间对山楂叶多酚得率的影响2.1.4超声温度对山楂叶多酚得率的影响（见图4）由图4可知，随提取温度升高，山楂叶多酚得率逐渐增大。当超声温度达55 ℃时，多酚得率最大，为0.58%，温度继续升高多酚得率反而下降，可能是因为温度升高溶质扩散速度增加，多酚类物质溶解性增大，大量多酚类物质溶出[26]。温度过高会导致多酚类物质结构不稳定，出现分解、氧化并转化为其他物质，使多酚类物质的得率降低。选择超声温度50、55、60 ℃作为响应面分析的3个水平较为适宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F004图4超声温度对山楂叶多酚得率的影响2.2响应面优化试验结果分析2.2.1Box-Behnken试验回归模型的建立及方差分析以山楂叶多酚得率为评价指标的响应值，选择乙醇浓度（A）、液料比（B）、超声时间（C）、超声温度（D）进行Box-Behnken试验优化，获取最佳提取山楂叶多酚的条件[27]。响应面试验结果见表2，方差分析结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.T002表2响应面试验结果试验号A/%B/(mL/g)C/minD/℃多酚得率/%100000.55200000.563-1-1000.42401000.40510-100.37600000.5770-1010.468-11000.629-10010.501000-1-10.161100-110.2712100-10.321300000.541410010.3615-10100.511610100.531700110.47180-1100.60190-1-100.282001-100.4521-100-10.222211000.412300000.5324010-10.3025-10-100.392601100.43271-1000.61280-10-10.2329001-10.2410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.T003表3方差分析结果方差来源平方和自由度均方F值P值显著性R2=0.997 0R2adj=0.993 9模型0.470140.034328.690.000 1**A3.00×10-413.000×10-42.910.109 9B8.33×10-618.330×10-60.0810.780 2C0.06210.062598.520.000 1**D0.08210.082793.140.000 1**AB0.04010.040388.440.000 1**AC4.00×10-414.000×10-43.880.068 8AD0.01410.014139.840.000 1**BC0.02910.029280.650.000 1**BD4.23×10-314.230×10-341.030.000 1**CD3.60×10-313.600×10-334.960.000 1**A21.54×10-311.540×10-314.970.001 7*B23.05×10-313.050×10-329.570.000 1**C20.04710.047459.580.000 1**D20.21010.2102 078.850.000 1**残差1.44×10-3141.030×10-4失拟项4.42×10-4104.420×10-50.180.987 9纯误差1.00×10-342.500×10-4总和0.48028注：**表示差异极显著（P0.01），*表示差异显著（P0.05）。应用Design-Expert 8.05软件进行回归拟合分析，得到提取条件与多酚得率间的二次多项式：多酚得率=0.55-5.00×10-3A+8.33×10-4B+0.072C+0.083D-0.1AB+0.01AC-0.06AD-0.085BC-0.032BD+0.03CD-0.015A2-0.022B2-0.085C2-0.18D2由表3可知，4个因素对山楂叶多酚得率影响程度的大小依次为DCAB。该二次多项次模型P0.000 1，说明多酚得率与各自变量之间的回归关系极显著。失拟项P=0.987 90.05，不显著，说明该试验数据和模型相符合程度显著，可用此模型对山楂叶多酚得率试验进行分析和预测，各变量因素对多酚提取效果的影响非简单的线性关系，具有交互作用。C、D、AB、AD、BC、BD、CD、B2、C2、D2达到差异极显著水平（P0.000 1），A2达到差异显著水平（P0.05），A、B、AC差异不显著（P0.05）。相关系数R2=0.997 0，调整决定系数R2adj=0.993 9，表明此模型可以解释99.39%山楂叶多酚得率的变化，且两系数相差不大，说明此模型拟合程度高、误差小，可用于山楂叶多酚得率的评价和分析。2.2.2响应面试验中交互项作用分析各因素交互对山楂叶多酚得率影响的响应面见图5。（f）超声时间和超声温度对多酚得率的影响图5　各因素交互对山楂叶多酚得率影响的响应面10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F5a1（a）乙醇浓度和液料比对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F5a2（b）乙醇浓度和超声时间对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F5a3（c）乙醇浓度和超声温度对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F5a4（d）液料比和超声时间对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F5a5（e）液料比和超声温度对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F5a6从图5可知，AB、AC、AD、BC、BD、CD交互项的等高线基本上呈马鞍形或椭圆形，其中AB组交互项的等高线图呈典型的马鞍形且其3D曲面图坡度变化陡峭；AC、AD、BD、CD交互项的等高线图呈椭圆形，说明AB、AD、AC、BD、CD交互项的交互作用影响较显著，其中CD交互项的交互作用影响最为显著即超声时间和超声温度交互作用对山楂叶多酚得率影响最显著。2.2.3提取工艺优化Box-Behnken模型优化得到多酚提取最佳工艺条件为乙醇浓度70.15%、液料比40.05 mL/g、超声时间25.33 min、超声温度56.18 ℃，多酚得率理论预测值为0.69%。验证响应面试验优化结果，考虑实际操作方便可行性，最佳工艺调整为乙醇浓度70%、液料比40 mL/g、超声时间25 min、超声温度55 ℃。3次平行试验得到山楂叶多酚得率的平均值为0.66%，验证结果与理论预测值相近，具有一定的实际应用价值。2.3山楂叶多酚体外降糖研究2.3.1山楂多酚对α-淀粉酶活性的影响（见图6）由图6可知，当山楂叶多酚提取物浓度为0.1~4.5 g/L时，浓度增大其对α-淀粉酶的抑制率逐渐增强。浓度为3.5 g/L时，对α-淀粉酶最高抑制率为83.3%，抑制效果接近浓度为1.0~1.5 g/L的阿卡波糖抑制效果。山楂叶多酚提取物对α-淀粉酶活性具有较好的抑制作用，多酚提取物可作为较强的α-淀粉酶活性抑制剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F006图6山楂叶多酚对α-淀粉酶的抑制曲线2.3.2山楂多酚对α-葡萄糖苷酶活性的影响（见图7）由图7可知，当山楂叶多酚提取物浓度为0.1~4.5 g/L时，随着多酚提取物浓度的增大其对α-葡萄糖苷酶的抑制率逐渐增强。在浓度为3.5 g/L时，对α-葡萄糖苷酶最高抑制率为88.7%，抑制效果接近浓度为1.0~1.5 g/L时的阿卡波糖的抑制效果。山楂叶多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性具有较强的抑制作用，该多酚提取物可作为较好的α-葡萄糖苷酶活性抑制剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F007图7山楂叶多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线2.4山楂叶多酚体外抑制胰脂肪酶效果研究（见图8）由图8可知，山楂叶多酚提取物在0.25~1.00 g/L内，山楂叶多酚浓度与胰脂肪酶的抑制率呈正相关。山楂叶多酚浓度为2.5 g/L时抑制率最高为46.8%，增加浓度，抑制率略有下降，说明山楂叶多酚提取物对胰脂肪酶活性具有一定的抑制作用，但抑制作用较弱，无法达到半抑制水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.05.016.F008图8山楂叶多酚对胰脂肪酶的抑制曲线3结论乙醇浓度为70%、液料比为40 mL/g、超声时间为25 min、超声温度55 ℃时，山楂叶多酚得率最高为0.66%，与理论预测值相近。山楂叶多酚体外抑制α-淀粉酶活性和α-葡萄糖苷酶活性能力较强。在山楂叶多酚浓度为3.5 g/L时，对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶最高抑制率分别为83.3%和88.7%。山楂叶多酚浓度为2.5 g/L时对胰脂肪酶有一定的抑制作用，抑制率最高为46.8%。