我国绵羊经目的性培育逐渐形成了适应性强且抗病、抗逆性强的品种[1]。因长期进行品种间杂交以及不断引进外来优势品种，许多地方特有的绵羊品种数量减少甚至濒临消失[2]。兰州大尾羊生长发育快、肉质丰满、耐粗饲，以尾部粗大、脂肪沉积多闻名[3]，灭绝频率为0.77，被国家列为濒临灭绝的遗传资源[4-5]。滩羊是优良裘皮用绵羊品种，但生长发育速度较慢[6]。藏羊可根据体型外貌、生产性能、分布地域划分为不同类群，但目前我国对藏羊系统发育关系的研究相对较少，对其起源等领域不甚了解[7]。小尾寒羊是肉裘兼用型的地方绵羊品种，繁殖、发育快速且具有较稳定的遗传性能[8]。线粒体DNA（mtDNA）是动物细胞中唯一存在于细胞核外的遗传物质，结构简单、进化快速且提取方便，广泛应用于家畜种及品种的起源、演化和分类的研究[9-10]。在mtDNA的编码基因中，细胞色素b（Cytb）基因的结构与功能的研究较清晰。Cytb基因的进化速率适中，包含从种内到种间的较强进化信号，故多采用Cytb基因研究物种间系统发育关系[11]。COX1基因变异速率适中，可避免碱基替换饱和的问题，适用于种群遗传多样性的分析[12]。本研究基于线粒体Cytb与COX1基因分析甘肃地区的绵羊品种兰州大尾羊、小尾羊、滩羊和藏羊的系统发育关系，与国内外其他绵羊品种进行比较，为种质资源的保护提供参考。1材料与方法1.1试验材料甘肃某羊场采取大尾羊、小尾羊、滩羊和藏羊的组织样本以及GenBank上下载的20个国内外绵羊品种的COX1与Cytb基因序列。1.2试剂与仪器2×Pro Taq预混液（艾科瑞生物）、琼脂糖（Boisharp）、50×TAE缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）。PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）、电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。1.3基因组扩增使用Gentra Puregene extraction kit从动物组织中提取纯度较高且分子量大的基因组DNA。参照GenBank已发表的绵羊COX1与Cytb基因序列设计引物，由宝生物工程（大连）公司合成。引物信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.009.T001表1引物信息Tab.1Primer information基因引物序列(5'→3')温度/℃产物大小/bpCOX1F:ACAGTCGGAATAGACGTCGA58622R:GGTTCTTCAAATGTGTGGTATGGCytbF:TGATCAACATCCGAAAAACC54994R:TTCGATGATGCTAGCTACTGGPCR扩增反应体系（25 μL）：10 mmol/L上游引物0.5 μL、10 mmol/L下游引物0.5 μL、50 μg/L DNA样品2 μL、5 U/μL PremixTaq（Takara）12.5 μL、无菌水9.5 μL。PCR的扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，58（54） ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。将扩增产物放置于含量为1.4%的琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪上观察结果。1.4构建发育树将成功扩增的4种绵羊的PCR产物送至兰州天启生物公司进行序列测定，反馈的测序结果通过Geneious 11.0.4进行处理原始文件AB1，将上下游的波峰进行拼接获得较为完整的序列波峰图，与NCBI上下载的相关基因完整序列进行进一步的校对，最终获得单个样本的完整序列，并与GenBank上下载的国内外绵羊品种的COX1和Cytb基因序列对比。通过MEGA-X进行比对处理，导出Fasta格式，再进行发育树的构建。GenBank上下载的国内外绵羊品种的序列见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.009.T002表2GenBank上下载的国内外绵羊品种的序列Tab.2Sequence of sheep breeds downloaded from GenBank物种名称中文名称序列号物种名称中文名称序列号Tushin图申羊KF938343.1Hamdani哈姆达尼羊MF004244.1Karadi卡拉迪羊MF004246.1Bashbay巴什贝羊KF938330.1Oparino奥帕里诺羊KF938352.1Kirghiz吉尔吉斯羊KF938334.1Hanzhong汉中羊KF938329.1Tashkurgan察库尔干羊KF938337.1Djallonke贾伦克羊KF977845.1Yecheng叶城羊KF938338.1Udmurtian德穆尔提安羊KF938341.1Turfan Black吐鲁番黑羊KF938324.1Kuibuskov库伊布斯科夫羊KF938346.1Qira Black乌拉黑羊KF938326.1Pramenka普拉门卡羊KF938347.1Oula Tibetan sheep乌拉藏羊KU575248.1Swiniarka斯威尼亚卡羊KF938349.1Bayinbuluke巴音布鲁克羊KF938331.1Sahelian萨赫勒羊KF977846.1Ovis ammon盘羊KT781689.1本研究构建发育树以盘羊为外群，分别采用邻接法（NJ）构建NJ树和最大似然法（ML）构建ML树。NJ树采用p-distance法计算遗传距离，Bootstrap重复选择为1 000次；ML树采用Find Best DNA/Protein Models选取BIC为最低值的相对模型作为最佳模型，Bootstrap重复1 000次。2结果与分析2.1COX1与Cytb基因的测序结果将成功扩增的PCR产物送至兰州天启生物科技有限公司测序，并将序列结果经Geneious11.0.4校对，与国内外其他绵羊品种的Cytb与COX1基因序列比较。结果显示，COX1基因样品序列为470 bp，Cytb样品序列为944 bp。利用MEGA-X软件的Statistic功能分析的Nucleotide Composition核苷酸组成，结果显示，COX1基因中A、T、G、C平均含量分别为29.3%、33.3%、14.5%、22.8%，A+T=62.6%，C+G=37.3%；Cytb基因中A、T、G、C平均含量分别为30.1%、27.1%、13.8%、29%，A+T=57.2%，C+G=42.8%。此外，在COX1基因中包含：保守位点450个、变异位点20个、简约变异位点6个、单突变位点14个、未简并位点306个、2倍简并位点82个和4倍简并位点78个；在Cytb基因中包含：保守位点888个、变异位点55个、简约变异位点16个、单突变位点39个、未简并位点606个、2倍简并位点166个和4倍简并位点158个。2.2基于COX1与Cytb基因的系统发育分析（见图1~图4）将最低BIC分数（贝叶斯信息标准）的模型作为遗传距离算法模型分析中的最佳模型，经MAGA-X的Model得知，COX1基因的BIC最低值对应的模型是T92∶Tamura 3-parumeter；Cytb基因的BIC最低值对应的模型是HKY∶Hasegawa-Kishino-Yano。由图1可知，COX1基因的ML树分为：图申羊、奥帕里诺羊等和小部分大尾羊、小尾羊、滩羊和藏羊为一支；乌拉藏羊、巴什贝羊等和大部分大尾羊、小尾羊、滩羊和藏羊为一支，其中滩羊S8、S9、S11、S13、S14、S15和藏羊T2、T10以及大尾羊D1和小尾羊X3、X4亲缘关系较近为一小支。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.009.F001图1基于COX1基因构建系统发育树（ML树）Fig.1Constructing phylogenetic tree based on COX1 (ML tree)注 ： 大尾羊编号为D1~D12，滩羊为S1~S16，小尾羊为X1~X11，藏羊为T1~T14；下图同。由图2可知，COX1基因的NJ树分为：图申羊、奥帕里诺羊等和一小部分大尾羊、小尾羊、滩羊和藏羊为一支；巴什贝羊、叶城羊等和绝大部分的大尾羊、小尾羊、滩羊和藏羊为一支，其中大部分滩羊样本与其他样本亲缘关系较近，聚为一小支。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.009.F002图2基于COX1基因构建系统发育树（NJ树）Fig.2Constructing phylogenetic tree based on COX1 (NJ tree)由图3可知，Cytb基因的ML树分为：藏羊T10单独一支；其他所有羊为一支，其中藏羊T2和小尾羊X3、X4的亲缘关系较近，成为单独的一小支。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.009.F003图3基于Cytb基因构建系统发育树（ML树）Fig.3Constructing phylogenetic tree based on Cytb (ML tree)由图4可知，Cytb基因的NJ树与其ML树大体相同：藏羊T10单独一支；其他所有羊为一支，其中小尾羊X7和大尾羊D6、D16由于亲缘关系较近成为一小支。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.009.F004图4基于Cytb基因构建系统发育树（NJ树）Fig.4Constructing phylogenetic tree based on Cytb (NJ tree)综上所述，COX1基因的NJ树和ML树均为两大支，大体一致；Cytb基因的NJ树和ML树的结构相似，均为藏羊T10单独成为一支。3讨论mtDNA已成为研究真核生物分子遗传学、发育生物学和分子系统进化的重要模式体系[13]。Cytb基因广泛应用于系统进化关系的研究，即使基因片段较小，但包含由种内到种间甚至科间的遗传进化信息[14]。细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ的结构具有高度保守的特点，且该基因的核苷酸进化速率较适中，适用于进化分析[15]。地球正面临着物种灭绝的严重威胁，应重视对种质资源的保护。本研究通过编码线粒体内膜上细胞色素b氧化酶基因的一个亚基Cytb和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ对4种绵羊的种质及与其他部分绵羊的基因序列比较进行研究；利用PCR扩增技术，确定最佳反应条件，对Cytb和COX1基因进行扩增和PCR产物测序，结果进行比对分析并建树。根据建树结果可知，在Cytb和COX1基因中均有4种绵羊与其他部分绵羊不同程度的亲缘关系。在COX1基因中，NJ树和ML树中除外群分为一支，再另分为两支，且均包括滩羊、藏羊、大尾羊和小尾羊的样本，说明4种绵羊与除盘羊外的19种绵羊均有亲缘关系，即其间存在基因流。在Cytb基因，NJ树和ML树除外群盘羊外，分为两大支，一支为藏羊T10的树，其余羊为一大支，说明藏羊T10与盘羊亲缘关系近，与其他绵羊的亲缘关系相比较远。在Cytb基因和COX1基因中的ML树和NJ树中出现4种绵羊聚为一支的现象，说明采取的绵羊样本中存在基因流。基因流会减少种群间的遗传差异，其强弱与程度也因种群与环境不同存在很大差异。绵羊间出现基因流导致原始品种资源减少，保护绵羊种质资源迫在眉睫。4结论研究表明，对甘肃地区4种绵羊的种质资源保护需要避免与其他物种间的基因流。地方特有绵羊品种数量减少甚至濒临灭绝，在后续研究中应采取多基因，更全面地分析系统发生关系，对研究甘肃地区的绵羊品种起源以及对绵羊品种的保护和利用具有一定意义。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.03.009.F005