山羊肉中含有较高的多不饱和脂肪酸（PUFA），有助于降低血液胆固醇含量，预防心血管疾病[1]。日粮中添加的富含PUFA的亚麻籽和亚麻油能够显著提高肉羊肌肉共轭亚油酸（CLA）及亚麻酸（ALA）等含量，降低SFA/PUFA和n-6 PUFA/n-3 PUFA[2-3]。亚麻油极易氧化生成苦味物质，影响日粮适口性，单独添加会导致肉羊日增重降低，瘤胃发酵功能产生一定的负面影响[4]。因此，提高PUFA的抗氧化能力及过瘤胃效果，是提升肉品质的重要途径之一。棕榈油具有很强的氧化稳定性[5]，可以降低绒山羊瘤胃C18∶3n-3的生物氢化作用和C18∶3n-3的肌肉氧化作用，亚麻油和棕榈油混合（混合油）添加后能够提高亚麻油的氧化稳定性[6]。因此，推测添加混合油可能具有提高亚麻油抗氧化能力、降低瘤胃氢化作用，增加机体C18∶3n-3及其衍生物的沉积，但作用机理及混合油添加适配比尚不清楚，混合油添加对绒山羊瘤胃中脂肪代谢及瘤胃菌群影响的研究较少。本试验选取内蒙古阿尔巴斯白绒山羊作为试验动物，通过体内试验研究日粮中添加不同配比棕榈油和亚麻油对羊瘤胃内脂肪代谢相关酶活性及微生物数量的影响，为生产中合理添加植物油脂以调控山羊脂类代谢、沉积、改善羊肉品质提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验采用3×3重复的拉丁方试验设计，选取12只年龄、体重相近的健康内蒙古阿尔巴斯白绒山羊羯羊，随机分为3组，每组4只，分别饲喂亚麻油（LSO组）、棕榈油（PMO组）和棕榈油与亚麻油混合油（LPO组）（棕榈油∶亚麻油为4∶6）。试验分为3期，预试期7 d，试验期21 d，试验期最后2 d采集瘤胃液。参照肉羊饲养2004版标准配制日粮，日粮组成及营养水平见表1。精粗比为5∶5，添加油总含量占全日粮的2%。每日8：30和15：00饲喂山羊，自由饮水。棕榈油与亚麻油比例依据课题组前期研究结果确定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.001.T001表1日粮组成及营养水平项目LSO组LPO组PMO组原料组成/%玉米秸秆47.8047.8047.80燕麦草2.202.202.20玉米32.9232.9232.92豆粕4.804.804.80玉米酒精糟3.303.303.30亚麻仁饼5.305.305.30预混料0.500.500.50石粉0.200.200.20碳酸氢钙0.200.200.20食盐0.300.300.30小苏打0.480.480.48亚麻油2.001.200棕榈油00.802.00合计100.00100.00100.00营养水平消化能/(MJ/kg)10.6110.6110.61粗蛋白/%10.1010.1010.10粗脂肪/%4.234.234.23中性洗涤纤维/%43.0943.0943.09酸性洗涤纤维/%23.4223.4223.42钙/%0.380.380.38磷/%0.300.300.30注：1.每千克预混料为日粮提供：VA 1 200 000 IU、VB1 70 mg、VB2 1 700 mg、VB6 180 mg、VB12 6 mg、VD3 500 000 IU、VE 2 500 IU、VK3 360 mg、D-泛酸3.4 g、烟酸4.4 g、生物素28 mg、叶酸300 mg、硒60 mg、铜1.6 g、锰6 g、锌10 g、碘60 mg、铁8 g、钴50 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.2样品采集与前处理瘤胃液口腔采集器于晨饲前0 h、晨饲后6 h采集瘤胃液，4层纱布过滤后取1~1.5 mL置于离心管，-20 ℃保存，用于测定脂肪代谢相关酶活性；另取1.5~2.0 mL置于冻存管，-80 ℃保存，用于提取DNA，测定瘤胃微生物数量。1.3测定指标及方法1.3.1瘤胃中脂肪代谢相关酶活性脂肪水解相关酶：激素敏感酯酶（HSL）、脂蛋白酯酶（LPL）；脂肪酸去饱和相关酶：硬脂酰辅酶A脱氢酶（SCD）、丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）、∆-5脂肪酸脱氢酶（FADS1）；脂肪合成相关的酶：脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、苹果酸脱氢酶（MDH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）、超长链脂肪酸延长酶（ELOVL5）。上述酶活性均采用酶联免疫法测定，试剂盒购自美国R&D公司，具体操作过程方法按照试剂盒说明书进行。1.3.2瘤胃微生物数量采用CTAB裂解法提取瘤胃培养液内微生物的总DNA，使用酶标仪（Synergy H1）测定DNA浓度及OD值，凝胶电泳检测条带完整性。参照SYBY Premix Ex TaqTM Ⅱ（Takala）试剂盒说明书，采用实时荧光定量PCR测定瘤胃内总细菌Total bacteria、蛋白分解丁酸弧菌（B. proteoclasticum）、亨氏丁酸弧菌（B. hungatei）、脂解厌氧弧杆菌（Anaerovibrio lipolytica）、白色瘤胃球菌（R. albus）数量。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.001.T002表2引物序列微生物种类引物序列（5'→3'）退火温度/℃长度/bp总菌上游：ACTCCTACGGGAGGCAG57465下游：GACTACCAGGGTATCTAATCC白色瘤胃球菌上游：CCCTAAAAGCAGTCTTAGTTCG54175下游：CCTCCTTGCGGTTAGAACA蛋白分解丁酸弧菌上游：CGCCTGCACGAAGCTGGAATC61190下游：CGGCTACCTTGTTACGACTTCACC亨氏丁酸弧菌上游：CGCCTGCACGAAGCTGGAATC61190下游：CGGCTACCTTGTTACGACTTCACC脂解厌氧弧杆菌上游：AGACACGGCCCAAACTCCTACG60157下游：TCCTCCTTGACCCATTTCCTGA1.4数据统计与分析数据采用Excel 2019软件进行计算和整理，SAS 9.0软件进行3×3拉丁方设计的方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1亚麻油、棕榈油及混合油对绒山羊瘤胃液中脂肪代谢相关酶活性的影响（见表3、表4）由表3可知，晨饲前0 h，PMO组绒山羊瘤胃内G6PDH活性较LSO组和LPO组具有升高的趋势（P0.05）；LPO组SCD活性较LSO组与PMO组具有一定的升高趋势（P0.05）；其他酶活性变化均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.001.T003表3亚麻油、棕榈油及混合油添加对绒山羊瘤胃中脂肪代谢相关酶活性的影响（0 h）项目LSO组LPO组PMO组SEMP值FAS/(U/mL)190.78168.82200.3516.070.400ACC/(ng/L)42.0845.1744.831.940.528G6PDH/(μg/L)95.1094.11103.612.110.080MDH/(IU/L)275.92291.77313.0318.990.425HSL/(U/L)198.27193.05200.535.770.706LPL/(μg/L)24.4123.8324.180.550.915SCD/(ng/L)116.79122.82111.342.310.099FADS1/(U/L)7.207.667.180.220.308ELOVL5/(U/L)15.2415.6314.560.240.212PDK4/(μg/L)0.890.930.940.020.226注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4与此同。由表4可知，晨饲后6 h，LSO组和LPO组绒山羊瘤胃液G6PDH、HSL、LPL和FADS1的活性显著高于PMO组（P0.05），LSO组与LPO组差异不显著（P0.05）；LSO组绒山羊瘤胃内SCD活性显著高于LPO组和PMO组（P0.05），ELOVL5活性显著高于PMO组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.001.T004表4亚麻油、棕榈油及混合油添加对绒山羊瘤胃中脂肪代谢相关酶活性的影响（采食后6 h）项目LSO组LPO组PMO组SEMP值FAS/(U/mL)196.94188.11193.666.730.696ACC/(ng/L)40.1039.8542.531.020.160G6PDH/(μg/L)98.07a100.57a92.33b0.730.015MDH/(IU/L)296.41305.10277.398.010.299HSL/(U/L)186.65a191.41a169.23b3.690.010LPL/(μg/L)23.99a24.02a21.76b0.330.039SCD/(ng/L)140.69a120.41b117.01b4.900.022FADS1/(U/L)7.15a6.72a5.90b0.200.006ELOVL5/(U/L)15.24a14.38ab13.99b0.240.037PDK4/(μg/L)0.870.940.940.020.1032.2亚麻油、棕榈油及混合油对绒山羊瘤胃液中微生物数量的影响（见表5、表6）由表5、表6可知，晨饲前0h，LPO组瘤胃内总细菌数较LSO组与PMO组有一定的降低趋势（P0.05）；蛋白分解丁酸弧菌、亨氏丁酸弧菌、脂解厌氧弧杆菌、白色瘤胃球菌数量变化均不显著（P0.05）。采食6 h后LPO组绒山羊；瘤胃内蛋白分解丁酸弧菌数量显著低于PMO组（P0.05），LSO组与LPO组和PMO组差异均不显著（P0.05）；其他微生物数量变化均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.001.T005表5亚麻油、棕榈油及混合油添加对绒山羊瘤胃内微生物数量的影响（0 h）项目总细菌蛋白分解丁酸弧菌亨氏丁酸弧菌脂解厌氧弧杆菌白色瘤胃球菌LSO组21.2819.6019.4119.3318.96LPO组20.5819.2919.2819.0619.03PMO组21.2219.2619.2419.3719.01SEM0.220.130.120.110.29P值0.0950.1920.5100.2250.987注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表6与此同。lg（拷贝数）/mL10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.001.T006表6亚麻油、棕榈油及混合油添加对绒山羊瘤胃内微生物数量的影响（采食6 h后）项目总细菌蛋白分解丁酸弧菌亨氏丁酸弧菌脂解厌氧弧杆菌白色瘤胃球菌LSO组21.1719.18ab19.1319.1818.52LPO组20.5318.92b19.1518.9618.71PMO组20.7319.61a19.2918.8018.84SEM0.210.120.090.100.18P值0.1900.0210.5820.1670.379lg（拷贝数）/mL3讨论反刍动物瘤胃是脂肪代谢的重要场所，脂肪进入瘤胃后在大量微生物和酶作用下进行脂解和氢化。HSL是脂类分解代谢必需的酶，在水解甘油三酯、动员脂肪、线粒体进行β氧化过程中起限速作用，其活性受日粮脂肪类型的影响[7]。LPL是调控脂肪代谢的关键酶，在甘油三酯代谢中起重要作用，能够将乳糜微粒和TG水解为甘油和分子质量较小的脂肪酸和单酰甘油[8-9]。研究表明，瘤胃中参与脂肪水解的主要微生物是Anaerovibrio lipolytica[10]，与LPL和HSL共同影响脂肪在瘤胃内的水解程度和速率。添加PUFA能够显著提高LPL和HSL等脂肪分解相关基因表达及酶活性[11-12]。本试验结果表明，晨饲6 h后，LSO组与LPO组绒山羊瘤胃液中LPL和HSL活性显著高于PMO组，说明绒山羊日粮中添加混合油，脂肪在瘤胃中的降解速率加快，效果优于单独添加棕榈油。亚麻油富含PUFA，含有亚麻油的LSO组和LPO组的PUFA含量均高于PMO组，LPL及HSL活性显著高于PMO组，与上述的研究结果相似。FAS和ACC是参与FA从头合成的关键酶，在动物脂肪合成中起关键作用[13]，二者通过调节细胞FA合成调控动物脂肪沉积[14]。PPARγ是许多脂肪合成基因的关键转录因子，上调与脂肪酸合成相关基因的表达，脂质积累过程往往伴随PPARγ基因的表达[15-16]。研究发现，日粮中添加植物性油脂可抑制脂肪合成酶活性，抑制脂肪从头合成[17-18]。但本试验结果显示，各添加组在0 h和6 h的瘤胃液中ACC、FAS活性差异不显著，原因可能与本试验未设不添加油脂的对照组有关。ELOVL6和SCD1是单不饱和脂肪酸合成的关键酶，FADS1参与脂肪酸去饱和延长过程。研究表明，富含C18∶3n-3的日粮可提高山羊皮下脂肪内HSL、PPARy和LPL的表达[19-20]。与单一n-3 PUFA日粮相比，混合油日粮增强了脂肪内HSL的活性[21]。EPA和DHA是两种功能性长链脂肪酸，具有抗氧化性、抗衰老作用[22]。UFA在ELOVL5和脂肪酸脱氢酶（如FADS1、FADS2）共同作用下转化为EPA和DHA，SCD、FADS1和ELOVL5活性升高有利于EPA和DHA的沉积[23]。本试验中，LPO组采用棕榈油部分替代富含C18∶3n-3的亚麻油，日粮中C18∶3n-3的浓度低于LSO组，但两组SCD、FADS1及ELOVL5活性无显著差异，且不同程度高于PMO组，利于长链PUFA生成。在大量微生物作用下，脂肪在瘤胃内被氢化脂解。游离的脂肪酸在微生物作用下发生异构化，形成氢化中间产物，随后转化为SFA，如日粮中亚油酸先异构为CLA,经氢化菌作用生成C18∶0[24]，这一过程主要依赖与丁酸弧菌属相关物种[25]。氢化C18不饱和脂肪酸的主要微生物是B. proteoclasticum和B. hungatei，是C18∶0生成的关键菌。若瘤胃微生物对日粮中PUFA生物氢化作用不完全，可使瘤胃中氢化中间产物CLA和反式碳烯酸蓄积，抑制脂肪酸从头合成[26]。瘤胃内氢化菌数量降低，C18∶3n-3的氢化作用减弱，进入后肠道数量增加，为组织生成n-3 LCPUFA提供更多底物。本试验结果表明，混合油组降低了B. proteoclasticum数量，减少了硬脂酸的生成。本研究仅探讨了瘤胃中脂肪的酶解和氢化作用，今后将进一步研究瘤胃液和组织中脂肪酸组成变化，为绒山羊日粮中添加植物油脂提供参考。4结论与棕榈油相比，亚麻油组或亚麻油与棕榈油混合添加可增强绒山羊瘤胃液中LPL、HSL、G6PDH、FADS1活性。亚麻油组可增强SCD和ELOVL5活性，混合油组绒山羊瘤胃内B. proteoclasticum的数量显著低于棕榈油组。棕榈油部分替代亚麻油，对瘤胃内脂肪水解酶活性、长链多不饱和脂肪酸产生促进作用，对瘤胃氢化菌数量具有降低作用，与单独亚麻油组具有相似的效果。