动物长期使用抗生素可以增加机体的耐药性和残留性，威胁人类健康。研究表明，停用抗生素会增加仔猪断奶后腹泻、病死率，降低仔猪免疫力和生长性能[1]，增加饲养成本和食品安全风险。植物甾醇具有良好的抗炎效果和促生长、延长动物生长寿命的作用[2-3]，能够参与体外免疫调节，具有抗炎和抑菌活性[4]。Vilahur等[5]和Lorenzo等[6]研究发现，植物甾醇可增加外周血单个核细胞的数量，提升动物抗炎活性。于学珍等[7]发现，植物甾醇凝胶可减小小鼠烧伤部位溃疡面积，抑制炎症细胞渗出。靳若周等[8]发现，植物甾醇对常见的致病菌具有抑制作用。许栋等[9]研究表明，饲料添加200 g/t植物甾醇可显著提高猪的平均日增重。但Hu等[10]认为，植物甾醇对仔猪的生长性能无显著影响。本试验旨在开发植物甾醇配方添加剂，系统评价植物甾醇子的使用效果，以期为植物甾醇替代抗生素在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验设计的植物甾醇配方添加剂由植物甾醇、胆固醇、大蒜素和菊粉组成。植物甾醇配方见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.009.T001表1植物甾醇配方配方组成含量/%来源植物甾醇15西安海斯夫生物有限公司胆固醇5安徽天启化工科技有限公司大蒜素10济南天天香有限公司菊粉70南京松冠生物科技有限公司白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、尿素氮（BUN）、生长激素（GH）、类胰岛素生长因子-1（IGF-1）、生长抑素（SS）和胰岛素（INS）ELISA检测试剂盒均南京建成生物工程研究所。1.2试验设计选取36头体重相近、状态良好的仔猪，随机分为4组，每组3个重复，每个重复3头猪。对照组仔猪饲喂不添加植物甾醇添加剂的基础日粮，试验组仔猪分别饲喂含500、1 500、3 000 mg/kg植物甾醇配方添加剂的日粮。预试期1 w，正式试验期6 w。基础日粮组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.009.T002表2基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米51.43代谢能/(MJ/kg)13.59豆粕21.72干物质/%88.31鱼粉6.00粗蛋白质/%18.26乳清粉11.00粗脂肪/%5.50白砂糖2.00粗灰分/%8.00葡萄糖2.00钙/%1.00豆油2.57总磷/%0.65食盐0.47石粉0.84磷酸氢钙0.41氯化胆碱0.02L-赖氨酸盐酸盐0.60L-苏氨酸0.21L-色氨酸0.04L-缬氨酸0.10DL-蛋氨酸0.19预混料0.40注：1.每千克预混料为日粮提供：VA 2 000 000 IU、VB1 1 000 mg、VB2 9 000 mg、VB5 10 000 mg、VB6 1 000 mg、VB12 5 mg、VD3 7 500 000 IU、VE 5 000 IU、VK3 500 mg、生物素37.5 mg、叶酸250 mg、D-泛酸300 mg、烟酸2 500 mg、抗氧化剂25 000 mg、铜250 mg、铁20 000 mg、锰20 000 mg、锌20 000 mg、碘100 mg、硒75 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其他均为实测值。1.3试验管理所有仔猪在同一猪舍饲养，自由饮食，免疫程序按照猪舍管理规定正常进行。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能预试期结束及正式试验期结束，仔猪称重，分别为初重、末重。正式试验期每日记录各组的采食量，每日采食量相加即为总采食量，观察仔猪腹泻情况，记录。平均日增重=(末重－初重)/正式试验天数(1)平均采食量=总采食量/(正式试验天数×仔猪数量)(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)腹泻率=总腹泻头数×发病天数/(仔猪头数×试验天数)×100%(4)1.4.2血液采集试验最后1 d，仔猪禁食禁水12 h，每头猪静脉取血15 mL，参照试剂盒说明书处理血液样品，配置标准品液、洗涤液。双抗体夹心法测定仔猪血清指标，使用酶标仪标记OD值。1.4.3粪便采集试验最后3 d采集仔猪的新鲜粪便，分成2组。一组冻干混合，参考于振洋等[11]的方法，采用酸不溶性灰分法测定消化率；另一组参考郝翔宇等[12]分离培养粪样，鉴定并测定乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌的含量。1.5数据统计与分析数据采用SPSS 20.0软件进行方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1植物甾醇配方对仔猪生长性能的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，低、中、高剂量组仔猪的末重均显著提高（P0.05），分别提高了8.49%、10.90%和12.33%；平均日增重均显著提高（P0.05），分别提高了11.29%、14.29%、17.28%；仔猪的腹泻率极显著降低（P0.01），分别降低了34.12%、58.38%和62.21%。结果表明，摄入植物甾醇配方可提高仔猪的生长性能，改善仔猪的平均日增重，降低料重比，减少腹泻率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.009.T003表3植物甾醇配方对仔猪生长性能的影响组别初重/kg末重/kg平均日增重/[kg/(头·d)]平均日采食量/[kg/(头·d)]料重比腹泻率/%对照组7.23±0.3425.31±1.320.434±0.0170.787±0.0881.81±0.1513.60±2.13低剂量组7.19±0.1727.46±1.01*0.483±0.007*0.815±0.0791.69±0.118.96±1.64**中剂量组7.22±0.2328.07±1.43*0.496±0.013*0.820±0.0741.63±0.085.66±2.14**高剂量组7.19±0.2628.43±0.96*0.509±0.009*0.825±0.0811.62±0.125.14±1.97**注：与对照组相比，“*”表示差异显著（P0.05），“**”表示差异极显著（P0.01）；下表同。2.2植物甾醇配方提高仔猪血清中生长因子含量的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，各剂量组仔猪血清GH活性均显著升高（P0.05），表明摄入植物甾醇配方可通过提高生长激素、抑制生长抑素提高仔猪的生长性能。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.009.T004表4植物甾醇配方对仔猪血清中生长因子含量的影响组别GH/(μg/L)IGF-1/(μg/L)SS/(ng/L)INS/(pIU/L)对照组1.27±0.43179.77±14.1825.33±2.1414.62±1.11低剂量组1.45±0.57*179.05±23.5124.54±1.9114.84±1.61中剂量组1.56±0.48*177.51±19.5323.57±1.7714.91±1.51高剂量组1.54±0.44*178.61±27.2923.02±1.8514.88±1.142.3植物甾醇配方对仔猪血清蛋白含量的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，各剂量组仔猪血清TP、ALB、GLB、BUN的含量和A/G差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.009.T005表5植物甾醇配方对仔猪血清蛋白含量的影响组别TP/(g/L)ALB/(g/L)GLB/(g/L)A/GBUN/(mmol/L)对照组30.13±1.1416.07±0.9124.66±2.110.65±0.073.72±0.15低剂量组32.79±1.8816.17±0.8724.73±2.310.65±0.193.61±0.52中剂量组34.57±1.6116.08±0.7525.07±1.930.64±0.103.34±0.57高剂量组34.66±1.9416.19±0.7325.18±1.880.64±0.153.31±0.812.4植物甾醇配方对仔猪腹泻率及免疫力的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，各剂量组仔猪血清IgG含量均极显著升高（P0.01），分别升高了40.09%、74.53%和71.70%；各剂量组仔猪血清IgA呈升高趋势，但差异不显著（P0.05）。结果表明，摄入植物甾醇配方可提高仔猪免疫力，降低仔猪腹泻率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.009.T006表6植物甾醇配方对仔猪腹泻率及免疫力的影响组别IgA/(g/L)IgM/(g/L)IgG/(ng/L)对照组1.43±0.370.46±0.072.12±0.33低剂量组1.50±0.410.43±0.142.97±0.51**中剂量组1.61±0.330.52±0.113.70±0.63**高剂量组1.57±0.460.50±0.193.64±0.59**2.5植物甾醇配方对仔猪炎症因子的影响（见表7）由表7可知，与对照组相比，各剂量组仔猪血清的炎症因子IL-6、IL-10含量均有所降低，但差异不显著（P0.05）；高剂量组仔猪血清TNF-α含量显著降低（P0.05），中剂量组仔猪血清TNF-α含量极显著降低（P0.01），低剂量组TNF-α含量有所降低，但差异不显著（P0.05）。结果表明，摄入植物甾醇配方可提高仔猪的免疫力，缓解仔猪炎症。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.009.T007表7植物甾醇配方对仔猪血清中炎症因子的影响组别IL-6IL-10TNF-α对照组46.51±7.64146.06±18.36245.70±31.97低剂量组44.08±8.17143.52±24.39207.31±24.44中剂量组43.50±8.77140.87±14.97185.88±23.72**高剂量组45.73±7.97136.05±22.41190.64±27.99*ng/L2.6植物甾醇配方对仔猪营养物质表观消化率的影响（见表8）由表8可知，与对照组相比，各剂量组仔猪干物质、粗脂肪及粗蛋白的表观消化率均有所提升，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.009.T008表8植物甾醇配方对仔猪营养物质表观消化率的影响组别干物质粗脂肪粗蛋白对照组83.79±1.4184.77±1.9784.07±1.35低剂量组84.51±1.2485.18±1.7885.03±1.47中剂量组85.14±1.7885.22±1.9685.36±1.73高剂量组85.34±1.3683.36±2.0586.14±2.02%2.7植物甾醇配方对仔猪肠道菌群的影响（见表9）由表9可知，仔猪肠道内敏感性菌大肠杆菌含量随剂量增加呈降低趋势，促进消化吸收的乳酸杆菌、双歧杆菌则呈逐渐升高趋势，但差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.009.T009表9植物甾醇配方对仔猪肠道菌群的影响 单位：lgCFU/g组别大肠杆菌乳酸杆菌双歧杆菌对照组8.67±0.217.83±0.138.90±0.13低剂量组8.14±0.118.37±0.069.13±0.09中剂量组8.03±0.098.12±0.079.33±0.19高剂量组7.81±0.188.52±0.099.37±0.113讨论3.1植物甾醇配方对仔猪生长性能的影响目前，酸化剂、益生菌、植物提取物和酶制剂等均可作为抗生素替代品的饲料添加剂。Tsiloyiannis等[13]研究发现，酸化剂可促进仔猪生长代谢，但过量的酸化剂导致食欲降低。益生菌代谢产生的益生元可以促进有益菌增殖，提高肠道益生菌含量。植物提取物如百里香、肉桂、苜蓿等可提高动物的平均日增重，改善动物的胴体品质，具有良好的抗菌效果[14]。外源性消化酶可有效提高仔猪生长性能[15]。Fang等[16]研究发现，动物体内的胆固醇无法由植物甾醇直接合成。GH/IGF-1轴是生长轴的重要组成部分，对机体的营养物质吸收和能量代谢起重要作用。研究表明，血清的GH和IGF-1含量与生长呈正相关[17]。SS是一种典型的脑肠肽，可抑制垂体释放生长激素。INS是重要的代谢激素，控制以靶点为肌肉、脂肪和肝脏的能量代谢。血清总蛋白分为白蛋白、球蛋白，反映代谢及营养状态。总蛋白升高表明蛋白质的合成代谢旺盛[18]，仔猪生长状态良好。本研究发现，经不同剂量的植物甾醇配方饲喂，仔猪的生长性能均得到不同程度的提升。植物甾醇配方通过提高生长激素的分泌，提高生长激素的半衰期，提高仔猪生长性能。血清中总蛋白升高，表明各剂量植物甾醇组生长状态良好，通过改善肠道菌群的健康程度，提高表观消化率，降低料重比，提高仔猪生长性能。3.2植物甾醇配方对仔猪免疫功能的影响血清中免疫球蛋白主要具有抗菌、抗病毒以及强化细胞吞噬作用，是免疫系统中重要的免疫效应因子[19]，含量降低表明机体免疫力降低[20]。机体发生细胞免疫后，T细胞被激活产生淋巴因子IL-6。IL-10是免疫应答中的调节剂，炎症发生可使IL-6和IL-10升高。巨噬细胞分泌的TNF-α是系统性炎症细胞因子，通过调节免疫细胞引发炎症，阻止肿瘤发生和病毒复制。当机体受细菌或病毒攻击时，血清中TNF-α含量升高[21]。IL-6、IL-10、TNF-α能够直接反映仔猪体内炎症的轻重程度，是评价机体健康的重要指标[22]。动物的免疫能力与饲养成本密不可分，腹泻影响仔猪对饲料的吸收，严重可导致死亡[23]。炎症发生会造成饲养动物能量损失[24]，影响生长性能和经济效益。本试验结果显示，饲喂植物甾醇配方可通过增加血清中免疫球蛋白数量提高免疫力，降低仔猪的腹泻率以及仔猪的炎症程度。4结论植物甾醇配方可提高生长激素分泌，改善肠道微生物，提高营养消化率，提升仔猪自身免疫力，减少腹泻和炎症对能量的消耗，达到提高仔猪生长性能以及免疫功能的效果。