叶酸是一种水溶性B族维生素，在体内参与甲基化反应、蛋白质与核酸的合成、氨基酸代谢等过程，是细胞增殖的重要作用因子，是生命的必需物质之一[1]。但人体无法合成叶酸，需要从外界获得。富含叶酸的食物主要有绿色蔬菜、豆制品、蛋黄等[2]。缺乏叶酸会导致中风[3]、神经功能认知障碍[4]以及骨质疏松[5]等疾病发生。妊娠期女性缺乏叶酸会影响胎儿神经管的发育，增加胎儿畸形的发生率，造成孕妇分娩危险[6-7]。目前，添加的叶酸多以人工合成、对人体利害不明的无生物活性形式存在[8-9]。蛋鸡可以将日粮中添加的无生物活性形式转化为5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）储存在鸡蛋蛋黄中。5-MTHF的生物利用率高达100%。本试验在华北柴鸡日粮中添加不同浓度的叶酸，探讨蛋黄中叶酸含量、蛋品质及产蛋量方面的差异，为畜牧业生产富叶酸功能性鸡蛋提供参考。1材料与方法1.1试验设计选用笼养华北柴鸡为试验对象，将315只生长性能相似的、健康华北柴鸡随机分为7组，每组3个重复，每个重复15只鸡。1组为对照组，柴鸡饲喂基础日粮，基础日粮购自大成万达（天津）有限公司，原料组成为玉米、豆粕（自转基因大豆）、花生粕、豆油、磷酸氢钙、石粉、氯化钠、氨基酸、维生素、矿物元素、植酸酶、复合酶制剂等。基础日粮营养水平见表1。2~7组为试验组，分别在基础日粮中添加浓度为300、600、1 200、1 800、2 400、3 600 mg/kg叶酸。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.013.T001表1基础日粮营养水平项目粗蛋白粗纤维粗灰分钙总磷氯化钠蛋氨酸水分保证值≥15.50≤8.00≤14.502.80~4.40≥0.400.20~0.80≥0.38~0.90≤14.00%预试期7 d，正式试验期28 d。正式试验期的第7、14和28 d随机收集35枚鸡蛋。15枚用于蛋品质的检测，20枚用于蛋黄中叶酸含量的检测。检测前，鸡蛋置于4 ℃冰箱保存。1.2主要材料与试剂叶酸标准品（CAS号50-30-3）购自西格玛奥德里齐公司；叶酸添加剂购自广州欧斯曼生物科技有限公司，批号为FA20032019；甲醇（色谱纯）购自德国默克（Merck）公司；高氯酸（分析纯）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；无水碳酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸购自天津市汇杭化工科技有限公司；0.22 μm有机滤膜购自天津市青创仪器仪表销售商行。1.3仪器与设备电子分析天平（FB223）购自上海舜宁恒平科学仪器有限公司；蛋壳颜色测定仪（TSS-QCR）购自北京天翔飞域科技有限公司；蛋形指数测定仪（BFJ009）购自日本FHK公司；蛋白高度测定仪（NFN382）购自日本FHK公司；蛋壳厚度测定仪购自哈尔滨量具刃具集团有限公司；罗氏比色扇购自天津市青创仪器仪表销售商行；高效液相色谱仪（Agilent-1260）购自安捷伦科技有限公司；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）购自安捷伦科技有限公司；超声波清洗机（SB-100D）购自宁波新芝生物科技股份有限公司；迷你混合仪（MIX-2500）购自杭州佑宁仪器有限公司；离心机（H1850R）购自长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司。1.4测定指标及方法1.4.1蛋黄中叶酸含量样品前处理方法依据《高效液相色谱法测定食品中的叶酸》[10]，根据试验条件调整。蛋清与蛋黄分离，蛋黄搅拌混匀，称取5 g蛋黄于250 mL锥形瓶，加入30 mL纯净水涡旋混匀，加入3 mL 60%的高氯酸涡旋混匀，转移至50 mL的棕色容量瓶定容，超声5 min，10 000 r/min离心20 min，过滤，抽取1 mL滤液经0.22 μm有机滤膜注射进入样瓶。液相条件：色谱柱为C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为60∶40（V∶V）的0.1%甲酸水溶液与甲醇的混合溶液；流速为0.5 mL/min；柱温为25℃；检测波长为280 nm；进样量为10 μL。1.4.2蛋品质指标电子天平称量蛋重、蛋清重、蛋黄重、蛋壳重。利用蛋形指数测定仪测量鸡蛋的横径长与纵径长，蛋形指数为纵径长与横径长的比值，正常范围在1.30~1.35，大于1.35为长蛋，小于1.3为短蛋[11]。采用不同浓度氯化钠水溶液测定鸡蛋密度。采用蛋壳颜色测定仪测定鸡蛋顶部、中部、钝部的蛋壳颜色。采用蛋黄和罗氏比色扇测定蛋黄颜色。采用蛋壳厚度测定仪检测鸡蛋顶部、中部、钝部的蛋壳厚度。蛋白高度测定仪测量蛋黄周围3个等距点的蛋白高度，结果取三者平均值，计算哈夫单位。哈夫单位=100 log(H－1.7W0.37＋7.57)(1)式中：H为平均蛋白高度（mm）；W为蛋重（g）。1.4.3产蛋量试验期为28 d，记录各组鸡每天的产蛋量，统计第7、14、28 d的产蛋量，进行数据分析。1.5数据统计与分析数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行均值间的多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1日粮添加叶酸对蛋黄中叶酸含量的影响（见表2）由表2可知，试验期间，2 400 mg/kg组蛋黄中的叶酸含量显著高于对照组与300 mg/kg组。第14 d，试验组的蛋黄中叶酸浓度达到饱和状态，2 400 mg/kg组蛋黄中叶酸的含量最高，达到1.581 μg/g。第14 d以后，试验组蛋黄中叶酸含量呈现下降的趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.013.T002表2日粮添加叶酸对蛋黄中叶酸含量的影响组别第7 d第14 d第28 d对照组0.873±0.029c0.899±0.018c0.878±0.030d300 mg/kg组1.270±0.053b1.411±0.048b1.287±0.044c600 mg/kg组1.304±0.055b1.435±0.063ab1.359±0.068bc1 200 mg/kg组1.363±0.037ab1.461±0.045ab1.377±0.049bc1 800 mg/kg组1.367±0.060ab1.476±0.069ab1.400±0.070abc2 400 mg/kg组1.530±0.075a1.581±0.051a1.561±0.055a3 600 mg/kg组1.416±0.059ab1.555±0.052ab1.499±0.062ab注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2日粮添加叶酸对蛋品质的影响（见表3~表6）由表3可知，试验第7 d，各组间鸡蛋的蛋重差异不显著（P0.05)；试验第14 d，3 600 mg/kg组鸡蛋的蛋重显著高于2 400 mg/kg组；第28 d，2 400 mg/kg组鸡蛋的蛋重显著高于对照组（P0.05）。第28 d，300、1 800 mg/kg组鸡蛋的相对密度显著高于对照组（P0.05）。各组间鸡蛋的蛋形指数差异不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.013.T003表3日粮添加叶酸对全蛋指标的影响组别蛋重/(g/只)相对密度/(g/mL)蛋形指数7 d14 d28 d7 d14 d28 d7 d14 d28 d对照组50.369±0.84249.504±1.068ab48.635±0.757b1.084±0.0021.082±0.0021.081±0.002b1.331±0.0311.346±0.0101.355±0.016300 mg/kg组48.897±0.94051.108±0.791ab50.304±1.211ab1.083±0.0021.087±0.0021.087±0.002a1.324±0.0121.341±0.0111.330±0.010600 mg/kg组49.912±1.09349.752±1.007ab51.371±1.008ab1.086±0.0021.086±0.0021.084±0.002ab1.304±0.0161.320±0.0091.318±0.0221 200 mg/kg组49.956±1.24651.120±0.644ab50.573±0.653ab1.087±0.0021.086±0.0011.086±0.002ab1.310±0.0161.346±0.0151.325±0.0241 800 mg/kg组50.719±0.95649.363±1.112ab51.074±0.904ab1.086±0.0021.085±0.0011.086±0.002a1.330±0.0131.330±0.0161.346±0.0102 400 mg/kg组51.026±1.21148.713±0.866b52.033±1.190a1.083±0.0021.086±0.0021.086±0.002ab1.322±0.0121.317±0.0101.347±0.0103 600 mg/kg组50.831±1.06551.994±0.714a49.625±0.832ab1.087±0.0021.085±0.0011.085±0.001ab1.328±0.0131.328±0.0131.343±0.013由表4可知，第7 d，300 mg/kg组的蛋壳重显著低于对照组（P0.05）；第14 d，1 200 mg/kg组的蛋壳重显著高于除1 800和3 600 mg/kg组外的其他组（P0.05）；第28 d，各试验组的蛋壳重均显著高于对照组（P0.05）。第14 d，300 mg/kg、600 mg/kg组的蛋壳颜色显著高于其他组（P0.05）；第28 d，1 800、2 400 mg/kg组显著低于对照组（P0.05）。第7 d，2 400 mg/kg组的蛋壳厚度显著低于1 800、3 600 mg/kg组（P0.05）；第14 d，300、600、2 400 mg/kg组的蛋壳厚度显著高于对照组（P0.05）；第28 d，各试验组的蛋壳厚度均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.013.T004表4日粮添加叶酸对蛋壳指标的影响组别蛋壳重/g蛋壳颜色蛋壳厚度/mm7 d14 d28 d7 d14 d28 d7 d14 d28 d对照组6.710±0.243a5.958±0.154b5.260±0.147b34.713±1.25433.693±1.288b36.820±0.983a0.303±0.007ab0.282±0.007b0.276±0.007b300 mg/kg组6.015±0.158b6.056±0.132b5.908±0.162a34.240±0.75139.447±1.141a35.073±0.846ab0.304±0.008ab0.301±0.005a0.309±0.007a600 mg/kg组6.257±0.144ab6.050±0.076b6.000±0.160a34.867±1.20240.100±1.178a34.980±0.668ab0.300±0.006ab0.300±0.006a0.305±0.007a1 200 mg/kg组6.546±0.166ab6.509±0.132a6.084±0.126a35.233±0.77633.893±0.890b34.733±0.970ab0.307±0.008ab0.298±0.005ab0.315±0.006a1 800 mg/kg组6.491±0.149ab6.184±0.199ab6.053±0.126a33.100±0.84136.113±1.196b32.760±0.824b0.320±0.004a0.296±0.006ab0.316±0.007a2 400 mg/kg组6.258±0.206ab6.014±0.125b6.253±0.134a35.187±1.22234.660±0.946b33.240±1.044b0.293±0.008b0.302±0.006a0.305±0.007a3 600 mg/kg组6.567±0.207ab6.273±0.155ab5.932±0.100a34.027±1.48835.573±1.070b35.740±1.242ab0.318±0.007a0.298±0.005ab0.307±0.004a由表5可知，，第7、28 d，各组间的蛋清重差异不显著（P0.05）；第14 d，300 mg/kg组的蛋清重显著高于1 800、2 400 mg/kg组（P0.05）。第7 d，3 600 mg/kg组鸡蛋的哈夫单位显著高于其他试验组（P0.05）；第14 d，各组间哈夫单位差异不显著（P0.05）第28 d，3 600 mg/kg组鸡蛋的哈夫单位显著高于对照组、300、600、2 400 mg/kg组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.013.T005表5日粮添加叶酸对蛋清品质的影响组别蛋清重/g哈夫单位7 d14 d28 d7 d14 d28 d对照组25.427±0.69726.074±0.781ab25.913±0.61588.276±1.272ab89.134±1.56687.863±0.963bc300 mg/kg组25.864±0.71128.099±0.575a26.742±1.06385.826±1.505b85.946±1.54587.846±1.140bc600 mg/kg组26.555±0.65725.844±0.875ab28.027±0.78586.156±1.648b89.326±1.78688.785±1.613bc1 200 mg/kg组26.401±0.57927.424±0.711ab27.083±0.45287.436±1.036b88.809±1.58889.629±1.221ab1 800 mg/kg组26.118±0.68525.717±0.774b27.624±0.71086.595±1.233b87.924±0.98990.028±0.908ab2 400 mg/kg组27.437±0.88625.680±0.695b27.584±0.87887.715±1.466b84.597±1.45585.491±1.275c3 600 mg/kg组26.991±0.87227.560±0.615ab26.506±0.62191.810±1.013a88.711±1.45992.740±0.831a由表6可知，试验期间，各组间蛋黄重与蛋黄颜色差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.013.T006表6日粮添加叶酸对蛋黄指标的影响组别蛋黄重/g蛋黄颜色7 d14 d28 d7 d14 d28 d对照组17.060±0.32516.724±0.39916.223±0.3177.600±0.1907.130±0.1926.730±0.316300 mg/kg组16.345±0.32016.491±0.30816.871±0.4177.600±0.2547.000±0.2397.000±0.234600 mg/kg组16.486±0.41316.657±0.36716.723±0.3247.270±0.3007.130±0.2157.270±0.3001 200 mg/kg组16.388±0.54216.446±0.31716.610±0.3527.400±0.2357.000±0.1697.330±0.2871 800 mg/kg组17.218±0.33416.685±0.32316.463±0.3597.800±0.2237.670±0.1876.800±0.2962 400 mg/kg组16.982±0.44016.818±0.32917.261±0.4067.400±0.1907.200±0.2626.600±0.3353 600 mg/kg组16.535±0.26317.232±0.25716.244±0.2967.730±0.2067.200±0.2796.870±0.322试验期间，添加叶酸未对蛋黄重、蛋黄颜色以及蛋形指数等指标造成影响，仅对蛋重、蛋清重、蛋壳重、蛋壳颜色、蛋壳厚度、相对密度和哈夫单位等蛋品质指标产生波动性影响。日粮添加叶酸对蛋品质的影响不显著。2.3日粮添加叶酸对产蛋量的影响（见表7）由表7可知，第7 d，2 400 mg/kg组蛋鸡的产蛋量显著高于1 800 mg/kg组（P0.05）；第14 d，600 mg/kg组蛋鸡的产蛋量显著高于1 800、2 400 mg/kg组（P0.05）；第28 d，1 800 mg/kg组蛋鸡的产蛋量显著低于300、600、1 200、2 400 mg/kg组（P0.05）。结果表明，日粮添加叶酸会对产蛋量产生波动性影响，对蛋鸡产蛋量影响不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.013.T007表7日粮添加叶酸对产蛋量的影响组别第7 d第14 d第28 d对照组25.86±0.595ab26.00±0.577ab25.29±0.650b300 mg/kg组27.43±0.972ab28.00±1.024ab28.29±0.815a600 mg/kg组28.43±1.212ab29.29±1.149a27.86±0.919a1 200 mg/kg组29.14±1.100ab28.14±0.595ab29.21±0.806a1 800 mg/kg组25.43±1.478b25.57±1.110b25.36±0.634b2 400 mg/kg组29.57±1.378a25.71±0.680b27.79±0.720a3 600 mg/kg组28.14±1.262ab27.71±1.672ab26.86±0.733ab个3讨论3.1日粮添加叶酸对蛋黄中叶酸含量的影响我国推荐成人叶酸摄入量为400 μg/d，孕妇叶酸摄入量为600 μg/d，哺乳期女性叶酸摄入量为500 μg/d[12-13]。但目前孕妇和超半数的青少年叶酸摄入量不达标[14-15]，需要通过服用叶酸补充剂、食用叶酸强化食品等补充叶酸，但两者成分均为人工合成，对人体的利害尚不明确[9]。人体对5-MTHF的利用率高达100%，蛋鸡可将蝶酰谷氨酸（PteGlu）转化为5-MTHF储存在蛋黄中。叶酸在鸡蛋中十分稳定，常温和低温的条件下储存27 d后含量无明显变化，且蛋黄中叶酸含量不受鸡蛋加工方式的影响[16]，鸡蛋可作为补充叶酸的良好载体。House等[17]以海兰白蛋鸡为试验对象，结果发现，鸡蛋中叶酸的含量随基础日粮中叶酸添加量的增加而增加；当添加量为4 mg/kg时，每个鸡蛋中叶酸含量最高达47 μg；当添加量超过32 mg/kg时，鸡蛋中叶酸含量可能继续增加。Hebert等[18]选取海兰白36蛋鸡和海兰白98蛋鸡为研究对象，结果发现，当叶酸添加量超过32 mg/kg时，鸡蛋中的叶酸含量并未继续增加；海兰白36蛋鸡叶酸最佳添加量为4 mg/kg，海兰白98蛋鸡最佳添加量为2 mg/kg。田传欢等[19]在海蓝褐鸡基础日粮中添加3 g/kg的叶酸，结果发现，蛋黄中叶酸含量随时间的增加而增加，养殖第21 d达到饱和状态。Sattar等[20]以海兰白36蛋鸡为研究对象，结果表明，基础日粮中叶酸的最佳添加量为15 mg/kg。目前，鸡蛋中叶酸一般为41~52 μg/蛋，含量较低[11]。本试验中，叶酸添加浓度为300、600、1 200、1 800、2 400、3 600 mg/kg，结果显示，蛋黄中叶酸含量随着时间的延长而增加，最终达到饱和；达到相同叶酸含量，低浓度组需要更长的时间；试验第14 d，2 400 mg/kg组鸡蛋中的叶酸含量达到最高，蛋黄中叶酸浓度为1.58 μg/g。因此，鸡蛋中叶酸的含量随日粮中叶酸添加量的增加而增加，但日粮中叶酸添加的最佳浓度和鸡蛋中叶酸的饱和量存在差异，可能与蛋鸡的种类、日龄、养殖模式等因素有关。3.2日粮添加叶酸对蛋品质的影响蛋黄重、蛋黄颜色、蛋形指数、相对密度以及哈夫单位等蛋品质指标均是评价鸡蛋的重要指标。本试验中，日粮中添加叶酸，各组间蛋黄重差异不显著，与杨艳[11]、Hebert等[18]的研究结果相同。蛋黄颜色主要与蛋黄中的色素沉积有关。本试验中，各组蛋黄颜色方面无显著性差异；试验期，仅对照组的蛋形指数在第28 d不在1.30~1.35范围，可能与蛋鸡的个体差异有关。哈夫单位能够反映鸡蛋的新鲜程度。新鲜鸡蛋的哈夫单位通常保持在72~85，最高可达90以上。本试验结果显示，各组哈夫单位均在72以上。日粮中添加叶酸可以显著提高蛋重和蛋壳厚度，但对蛋壳重、蛋形指数以及哈夫单位等指标无显著影响[20]。本试验中，日粮添加不同浓度的叶酸对各组的蛋黄重、蛋黄颜色、蛋形指数无显著影响，仅在蛋重、蛋清重、蛋壳重、蛋壳颜色、蛋壳厚度、相对密度以及哈夫单位等蛋品质指标方面造成波动性影响，结果不同，原因可能与蛋鸡种类、日龄、生长性能等因素有关。3.3日粮添加叶酸对产蛋量的影响产蛋量是蛋鸡重要的经济指标之一。Sattar等[20]研究发现，日粮中添加叶酸可以显著提高蛋鸡的产蛋量。本试验中，试验第7 d，2 400 mg/kg组蛋鸡的产蛋量显著高于1 800 mg/kg组；第14 d，600 mg/kg组蛋鸡的产蛋量显著高于1 800、2 400 mg/kg组；第28 d，300、600、1 200、2 400 mg/kg组的产蛋量显著高于对照组和1 800 mg/kg组。日粮添加叶酸对产蛋量的影响不显著。4结论笼养华北柴鸡日粮中叶酸添加量大于300 mg/kg时，可显著增加鸡蛋中叶酸的含量，对蛋品质和产蛋量无显著影响。