开发利用新型饲料原料能够促进畜牧业的发展。王健等[1]使用白酒糟替代部分青贮料饲喂肉羊，结果发现，50%白酒糟替代50%青贮饲料能够得到较高的经济效益。华金玲等[2]采用花生秸秆与青贮玉米搭配，结果发现，花生秸秆与青贮玉米搭配比例为25%~50%可以促进瘤胃微生物活性。贾亚洲等[3]研究桑叶饲料对山羊生产性能的影响，结果发现，在日粮中添加一定比例的青贮桑叶可提高生长育肥羊的生产性能。目前，关于食品加工副产品开发的新型饲料的研究较多，且取得了很好的效果。贺兰山东麓适合种植葡萄，葡萄大部分应用于酿酒[4]。葡萄酒生产过程中可产生大量的葡萄残渣，其主要成分有葡萄皮、葡萄籽、葡萄梗等，营养价值高，包括多种多酚类生物活性物质[5]。葡萄残渣及其提取物在畜牧生产中应用可适当缓解饲料资源短缺问题，保护环境，节约资源，提高动物生产性能等[6-9]。本试验使用不同比例的葡萄渣代替牛日粮中的苜蓿，采用体外产气法，研究不同替代组合瘤胃的产气量和对发酵底物降解率的影响，为葡萄渣在牛料中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料发酵底物样品为葡萄渣和苜蓿。葡萄渣为宁夏大学农学院食品工程中心酿酒后的副产物；苜蓿采摘后干燥，粉碎，过40目筛。1.2试验动物和地点选取平吉堡奶牛三场1头健康、体态良好、装有永久瘤胃瘘管的奶牛。体外试验于宁夏大学农学院实验室进行。1.3试验设计试验前期测定发酵底物营养成分含量。试验分为5组，试验Ⅰ组日粮不添加葡萄渣，试验Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组日粮中葡萄渣与苜蓿的比例分别为20∶80、30∶70、40∶60、50∶50。体外产气试验：取每组饲料样品500 mg，每个样品3个重复，分别在培养至3、6、9、12、24、48 h时记录产气量。发酵结束取上清液，4 ℃冷藏，用于测定48 h发酵液pH值、微生物蛋白、氨态氮和干物质降解率。1.4试验方法1.4.1体外培养装置培养管为100 mL的玻璃注射器，最小刻度为1 mL，注射器前端安装乳胶管，乳胶夹子封闭。为防止气体泄漏，需要在注射器芯壁均匀涂一层凡士林。1.4.2缓冲液的配制（见表1）配制缓冲液后通CO2达到饱和状态，升温至39 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.019.T001表1缓冲液的配制项目组成微量元素溶液（A液）13.2 g CaCl2·2H2O、10.0 g MnCl2·4H2O、1.0 g CoCl2·6H2O、8.0 g FeCl3·6H2O加蒸馏水至100 mL缓冲溶液（B液）4.0 g NH4HCO3、35 g NaHCO3加蒸馏水至1 000 mL常量元素溶液（C液）5.7 g Na2HPO4、6.2 g KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O加蒸馏水至1 000 mL刃天青溶液0.1% m/v还原剂溶液4.0 mL 1 mol/L NaOH、625.0 mg Na2S·9H2O加蒸馏水95 mL混合缓冲液400 mL蒸馏水+0.1 mL A液+200 mL B液+200 mL C液+1 mL 刃天青溶液+40 mL 还原剂溶液1.4.3瘤胃液的采集采集试验牛的瘤胃液，厌氧条件下使用搅拌器振荡3次以上，每次30 s，4层纱布过滤。1.4.4混合培养液的制备瘤胃液∶缓冲液的比例为1∶2，加入经CO2饱和、预热的缓冲液玻璃瓶，配制混合培养液，加入数滴刃天青溶液。混合培养液边加热边使用磁力搅拌器搅拌，通入CO2直至溶液褪为无色。1.4.5体外培养试验称取500 mg样品，使用长柄勺将样品送至注射器前端，不加样品的培养管作为空白管。向注射器中加入30 mL混合培养液。将注射器前端竖直向上，排尽管内空气，封闭，倒置在已预热至39 ℃的水浴摇床，记录注射器活塞的初始刻度值（mL），开启水浴摇床培养。记录各个时间段产气量，培养结束，将剩余物离心取上清液用于测定pH值、氨态氮、微生物蛋白等。1.5测定指标及方法1.5.1概略营养成分含量定按照饲料常规方法测定样品的钙（Ca）、粗灰分（Ash）和吸附水含量。使用自动凯氏定氮仪测定粗蛋白质（CP）含量，使用索氏抽脂器测定粗脂肪（EE）含量，使用范氏洗涤纤维分析法测定中性洗涤纤维（NDF）含量，使用比色法测定磷含量。1.5.2瘤胃氨态氮、微生物蛋白和pH值分别在3、6、9、12、24、48 h体外发酵，剩余物离心得上清液，参考冯宗慈等[10]方法测定氨态氮浓度；使用pH计测定发酵液的pH值。微生物蛋白：100目纱布过滤的新鲜瘤胃液1.5 mL于2 mL的离心管3 000 r/min离心5 min，移上清至1.5 mL离心管，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min弃去上清，离心管内加入1.5 mL 0.25 mol/L的NaOH溶液，沸水浴中反应20 min，4 ℃ 1 200 r/min离心30 min，取100 μL上清于10 mL玻璃管，加考马斯亮蓝溶液5 mL混匀，595 nm处比色。以牛血清白蛋白作为标准品，制作标准曲线。1.6数据统计与分析采用Excel 2013进行数据初步整理，采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1试验样品营养水平（见表2）由表2可知，葡萄渣中粗灰分（Ash）、粗蛋白（CP）、钙（Ca）分别比苜蓿低34.53%、39.22%和73.68%，吸附水、粗脂肪（EE）、中性洗涤纤维（NDF）分别比苜蓿高3.97%、1 800.00%、9.71%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.019.T002表2试验样品营养水平（干物质基础）项目吸附水AshCPEENDFCaP葡萄渣7.865.2711.1710.2635.580.050.02苜蓿7.568.0518.380.5432.430.190.02%2.2不同比例葡萄渣和苜蓿组合对体外产气量的影响（见表3）由表3可知，组内产气量随发酵时间的增加而增加。发酵3、6 h随葡萄渣添加量的增加产气量呈先升高后降低的趋势；9、12、24、48 h随葡萄渣量的增加产气量呈现先降后升再降的趋势。发酵3 h，Ⅱ组产气量显著高于Ⅰ组（P0.05）。发酵6、9 h，Ⅲ组产气量显著高于其他组（P0.05）。发酵12 h，Ⅲ组产气量显著高于其他组（P0.05）。发酵24 h，Ⅲ组、Ⅳ组产气量显著高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅴ组（P0.05），Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅴ组间差异不显著（P0.05）。发酵48 h，Ⅲ组产气量显著高于其他组（P0.05），但Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅴ组间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.019.T003表3不同比例葡萄渣和苜蓿组合对体外产气量的影响时间/hⅠ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组Ⅴ组314.25±1.50c23.67±2.52a23.25±0.96a18.00±1.00b14.50±2.38c633.00±2.94b38.00±3.61b45.25±0.96a37.00±0.00b31.75±3.30b957.25±1.71b56.67±4.04b63.00±0.82a60.33±0.58b59.75±0.96b1269.61±4.49b64.33±3.06c75.25±2.74a71.67±0.58b69.00±3.56b2478.75±4.11b78.00±2.65b93.75±7.85a89.67±2.08a77.00±6.78b4886.75±2.99c85.00±3.61c100.50±7.14a94.67±2.52b88.25±7.85c注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mL2.3不同比例葡萄渣和苜蓿组合对氨态氮含量的影响（见表4）由表4可知，随葡萄渣添加比例的增加，氨态氮含量呈先增长后降低的趋势。葡萄渣和苜蓿比例为30∶70时，氨态氮含量最高。以Ⅰ组氨态氮含量最低，但各组间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.019.T004表4不同比例葡萄渣和苜蓿组合对氨态氮含量的影响项目Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组Ⅴ组氨态氮含量14.18±0.7314.57±0.5014.70±0.4714.48±0.2714.27±0.47mg/100 mL2.4不同比例葡萄渣和苜蓿组合对微生物蛋白及pH值的影响（见表5）由表5可知，体外发酵48 h，MCP含量在葡萄渣和苜蓿比例为20∶80时最高；在葡萄渣和苜蓿比例为40∶60时最低。不同葡萄渣和苜蓿组合间MCP浓度和pH值差异均不显著（P0.05），不加葡萄渣时pH值最高为6.79。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.019.T005表5不同比例葡萄和苜蓿渣组合对微生物蛋白（MCP）及pH值项目Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组Ⅴ组MCP/(mg/100 mL)52.51±10.5353.26±14.8345.30±7.2948.19±15.8743.68±3.66pH值6.79±0.046.77±0.056.75±0.046.75±0.076.75±0.032.5不同比例葡萄渣和苜蓿组合对干物质降解率的影响（见表6）由表6可知，不同葡萄渣和苜蓿组合对干物质降解率的影响差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.019.T006表6不同比例葡萄渣和苜蓿组合对干物质降解率的影响组别干物质降解率/%Ⅰ组62.49±4.94aⅡ组62.12±5.33aⅢ组63.50±5.86aⅣ组62.99±4.96aⅤ组60.59±4.86a%葡萄渣和苜蓿比例为30∶70时干物质降解率最高，为63.50%。葡萄渣和苜蓿比例为50:50时降解率最低，为60.59%。3讨论3.1葡萄渣不同添加比例对体外产气量的影响碳水化合物和蛋白质通过瘤胃微生物降解产生甲烷等气体，体外产气量与瘤胃降解率有关，体外产气量是一种能够更快速测定饲料在瘤胃中降解程度的方法[11]。产气量能够直接反映瘤胃微生物对饲料的发酵程度[12]。产气多发酵快，产气少发酵慢，产气量能够显著影响干物质的消化率[13-15]。本试验中，同组内随发酵时间增加，产气量增加；相同发酵时间，不同组间除3 h产气量无显著差异外，其余各时间段均呈先升后降的趋势。葡萄渣和苜蓿比例为30∶70时产气量最高。因此，添加一定比例的葡萄渣可以提高产气量和发酵率，改善生产效率。葡萄渣中的粗蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维的含量丰富[16-17]。本试验中，葡萄渣和苜蓿的粗蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维含量分别是11.17%、10.26%、35.58%和18.38%、0.54%、32.43%；与苜蓿相比，葡萄渣粗蛋白含量低，但具有更高含量的粗脂肪和中性洗涤纤维。实际生产中添加比例对生产效果影响很大，需要更多研究进行探索。田华勤[18]研究发现，湖羊羔羊日粮中添加葡萄渣可提高中性洗涤纤维、粗脂肪的表观消化率和氮存留率。李会菊[19]研究表明，日粮中添加8%的葡萄渣可提高成年小尾寒羊母羊的增重，降低料重比和饲料成本，效果优于其他比例。古丽帕夏·吐尔逊等[20]研究发现，绵羊日粮中使用葡萄渣代替玉米秸秆可以增加绵羊平均日增重。日粮中添加16%葡萄渣能够显著降低成年母羊增重[21]；适当的葡萄渣添加量能够能提高羊的增重[22]；提高蛋鸡蛋品质，改善蛋鸡血液生化指标，增强蛋鸡抗氧化能力[23]，提高产蛋高峰后期蛋鸡抗氧化能力[24]。因此，葡萄渣是一种营养价值较高的饲料原料，针对不同动物、不同生产阶段，适当添加葡萄渣可降低成本，提高生产性能。3.2不同葡萄渣和苜蓿组合对氨态氮（NH3-N）的影响瘤胃NH3-N浓度是饲料中蛋白质和含氮物质降解的反应，是合成菌体蛋白的主要原料。NH3-N浓度范围在6~30 mg/100 mL时不影响动物的正常生理活动[25]。本试验中，NH3-N平均浓度在13.93~14.94 mg/100 mL之间，属正常范围，说明葡萄渣代替50%内的苜蓿不影响蛋白质降解。彭婉婉[9]研究发现，葡萄籽添加量大于12%时，粗蛋白的降解率降低，会限制微生物利用NH3-N合成自身蛋白质的速率。因此，饲料中的葡萄籽渣含量不宜过多，否则会影响动物自身利用蛋白的能力。3.3不同葡萄渣和苜蓿组合对发酵液微生物蛋白和pH值的影响日粮中的含氮物质进入瘤胃，在瘤胃微生物作用下转化为NH3-N，部分NH3-N被瘤胃微生物利用合成微生物蛋白。微生物蛋白质合成需要以氨的形式获得氮和能量。微生物蛋白量可衡量氮代谢水平。葡萄渣中含有一种特殊的物质单宁[26]。研究表明，日粮中添加单宁可降低瘤胃产气量、降低微生物蛋白的合成率[27]。本试验中，葡萄渣比例为20%时微生物蛋白的浓度最高，且高于不添加葡萄渣组，说明适当添加葡萄渣可以提高发酵液中微生物蛋白的含量。瘤胃内环境pH值能够决定微生物活性，一般瘤胃pH值在5.5~7.5[28]。本试验中，瘤胃内环境pH值均在6.75~6.77。因此，本试验添加比例的葡萄渣不会对瘤胃微生物产生不利影响。彭婉婉等[9]研究发现，随着葡萄渣的添加量增加，48 h发酵液的pH值升高，变化范围为5.87~6.44且均在正常发酵范围内，说明本试验条件下的葡萄渣的不同比例对内环境无影响。4结论葡萄渣和苜蓿比例为30∶70时，产气量和氨态氮含量最高；比例为20∶80时，微生物蛋白含量最高。葡萄渣和苜蓿比例对pH值和干物质降解率无显著性影响。因此，葡萄渣替代苜蓿适宜比例为20%~30%。