抗生素作为动物促生长剂能够给养殖带来良好的经济效益[1]，但持续且滥用抗生素，易引起耐药性、肠道微生物菌群稳态变化、药物残留等问题[2-3]。益生菌能够维持畜禽肠道微生物平衡，激活畜禽肠道黏膜的免疫组织，对黏膜免疫具有重要影响[4-5]。但只有具有安全性、能够在肠道定植以及对胃、肠液环境具有耐受性的益生菌才能够在动物生产中应用[6-7]，且应用的益生菌需要具有耐受饲料中高Zn、Cu等重金属、高热或低温环境生长繁殖、抗氧化能力等潜力。将益生菌的潜力以不同比例加权值或选取部分潜能加以检测，最终得到所需益生菌种类[8-9]。芽孢杆菌具备很强的产脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶能力，能够有效降解饲料中复杂的碳水化合物[10-11]。芽孢杆菌具有耐胆汁、耐酸、易储存加工和运输的优点，在畜禽生产中广泛应用[12-14]。本试验从健康肉鸭的粪便中筛选具有益生功效的候选益生芽孢杆菌，为肉鸭益生芽孢杆菌产品的开发和应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料新鲜屠宰肉鸭的盲肠内容物以及健康肉鸭新鲜粪便样品采自武汉市农科院畜牧兽医研究所的试验鸭场，4 ℃保存。1.2指示菌沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌ATCC标准菌株由本实验室保存。1.3主要试剂及培养基LB培养基（g/L）：蛋白胨10 g、牛肉浸粉5 g、氯化钠5 g，121 ℃高压灭菌；固体培养基加入12~15 g琼脂。0.85%生理盐水（g/L）：氯化钠8.5 g，121 ℃高压灭菌。淀粉水解培养基：称取63.0 g淀粉水解培养基，溶解于1 000 mL蒸馏水，121 ℃、15 min高压灭菌。酪蛋白琼脂：称取35.0 g酪蛋白琼脂，溶解于1 000 mL蒸馏水，分装，高压灭菌。纤维素刚果红培养基：称取25.3 g纤维素刚果红培养基，溶解于1 000 mL蒸馏水，分装，高压灭菌。稀盐酸：盐酸234 mL，加水稀释至1 000 mL。1.4菌株筛选1.4.1菌株初筛及镜检采集健康肉鸭的新鲜粪便，称取约1 g粪便，使用无菌生理盐水溶解，振荡混匀，放入80 ℃恒温水浴锅水浴，15 min取出，室温中静置冷却。上清液进行梯度稀释，吸取稀释后的样品100 μL涂布至LB固体培养基上，完成接种的LB培养基放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。选取长势较好、有单菌落的平板保存，挑取平板上的单菌落进行镜检及芽孢染色，若挑取的菌株能够产生芽孢并且是革兰氏阳性菌，则对该菌株进行进一步的分离纯化。1.4.2模拟人工肠液和人工胃液耐受性检测人工胃液：使用灭菌水配制，0.3%胃蛋白酶Pepsin+0.5%NaCl，调至pH值为2.0，使用0.22 μm细菌过滤器除菌。人工肠液：使用生理盐水配制，胰酶0.1%、胆盐0.3%，使用0.22 μm细菌过滤器除菌。取适量发酵液于12 000 r/min离心5~10 min，洗涤沉淀转入人工胃液，37 ℃培养2 h。取上述培养后的菌液10 mL离心，洗涤沉淀，转入人工肠液，37 ℃培养5 h。取适量发酵液离心，洗涤沉淀，悬浮菌液，LB平板涂布，有氧条件下37 ℃培养，对菌株进行接种，纯化。1.4.3产蛋白酶能力检测采用点种法检测分离菌株分泌蛋白酶能力。配制酪蛋白培养基1 000 mL，采用无菌牙签蘸取分离纯化的单菌落，点种于酪蛋白平板上，每个菌株2个平板，每个平板3个重复，于37 ℃培养24 h，分别测量水解圈直径（H）和菌落直径（C），计算H/C值，取平均值。1.4.4产淀粉酶和纤维素酶能力检测采用点种法检测分离菌株分泌淀粉酶和纤维素酶能力。配制淀粉酶培养基和纤维素酶，使用无菌牙签蘸取分离纯化后平板上的单菌落，点种于酪蛋白平板上，每个菌株2个平板，每个平板3个重复。于37 ℃培养36 h，分别测量水解圈直径（H）和菌落直径（C），计算H/C值，取平均值。1.4.5抑菌能力检测筛选出的菌株（菌株3、14、15、21、22）以及平板活化后的指示菌：大肠杆菌、沙门氏菌以及金色葡萄球菌，分别接种于LB液体培养基中，37 ℃ 200 r/min摇床培养24 h。各取1 mL细菌培养液，6 000 r/min离心5 min收集菌体，去除上清，菌体沉淀使用灭菌生理盐水洗涤，调整菌悬液的浓度，保证菌的浓度至108 CFU/mL，采用滤纸片法测菌株抑菌能力。1.4.6药敏试验检测按1.4.5的方法制备芽孢杆菌菌悬液，涂布于LB固体培养基上，将药敏片平贴于平板，轻压，每种药敏片进行3组平行试验，平板室温放置30 min，于37 ℃培养箱中培养24 h记录结果。1.4.7菌株黏附性检测试验采用体外黏蛋白模型评价候选菌株的黏附能力。黏液蛋白的制备：黏液来自健康肉鸭的小肠，方法步骤是取出肠组织，使用无菌的PBS冲洗2次，纵向剪开肠管，使用手术刀片轻轻刮取肠道的内表面，得黏膜蛋白混合物，将黏蛋白的浓度调整为1.0 g/L。菌悬液的制备：取适量菌株发酵液，6 000 r/min离心10 min收集菌体，进行活菌计数。黏附试验：取黏液蛋白溶液在室温中解冻，在96孔培养板中加入黏蛋白，置于4 ℃冰箱过夜，黏蛋白固定的96孔板使用PBS清洗，重复3次，除去未固定的黏液蛋白；向细菌黏附板中加入细菌悬液，37 ℃孵育1 h，使用PBS冲洗，重复3次；向细菌黏附板中加入0.1%的Triton X-100的细菌裂解液，37 ℃孵育30 min；梯度稀释后涂布于LB琼脂平板，计数，计算黏附率。黏附率=黏附后的细菌数量/初始细菌数量×100%(1)1.5PCR扩增及16S rDNA测序采用细菌基因组DNA提取试剂盒法提取候选菌株DNA，以候选菌株基因组DNA为模板，进行16S rDNA基因PCR扩增，产物送武汉擎科生物科技有限公司测序，根据测序结果，构建细菌系统发育树。2结果与分析2.1鸭源芽孢杆菌的分离经多次试验，从健康肉鸭的粪便中分离出革兰氏阳性的芽孢杆菌，芽孢杆菌11染色结果见图1。图 1芽孢杆菌11染色结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F1a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F1a22.2人工胃液与人工肠液耐受能力经过2 h的模拟胃液，经过5 h的模拟肠液处理，菌株耐受性检测结果见图2。由图2可知，筛选菌株大部分长势较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F002图2菌株耐受性检测结果（a） 人工胃液 （b） 人工肠液2.3芽孢杆菌分泌蛋白酶的能力（见图3、表1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F003图3菌株44产生的蛋白酶水解圈由表1可知，从人工胃液和人工肠液所分离的芽孢杆菌均能够产生蛋白酶水解圈，但菌株产蛋白酶能力大小差异相对较大，最小的Hc值如33仅为1.19左右，而最大的Hc值如44高达3.87。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.T001表1芽孢杆菌产蛋白酶结果菌株编号Hc值菌株编号Hc值菌株编号Hc值12.04±0.11152.50±0.49331.19±0.1121.53±0.06172.62±0.34342.24±0.4432.02±0.06201.95±0.26362.06±0.5541.64±0.07212.58±0.18372.29±0.5451.67±0.10222.56±0.26382.36±0.7161.98±0.18232.79±0.30392.84±0.5271.54±0.07242.17±0.44401.55±0.2881.89±0.15261.61±0.42412.07±0.5391.79±0.16271.82±0.49422.28±0.39101.58±0.05281.25±0.09443.87±0.67132.64±0.27291.97±0.33452.36±0.69142.55±0.63311.35±0.132.4芽孢杆菌分泌淀粉酶的能力（见图4、表2）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F004图4菌株22产生的淀粉酶水解圈由表2可知，在产淀粉酶试验中，除菌株29之外，其余均能够产生透明水解圈，但菌株水解圈的Hc值比较偏小，只有菌株14水解圈的Hc值在2.0以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.T002表2芽孢杆菌产淀粉酶结果菌株编号Hc值菌株编号Hc值菌株编号Hc值11.45±0.21151.52±0.16331.11±0.0221.33±0.04171.40±0.13341.14±0.0631.58±0.18201.23±0.05361.09±0.0341.25±0.14211.88±0.14371.13±0.0651.21±0.08221.80±0.14381.09±0.0461.21±0.03231.57±0.46391.25±0.0271.41±0.11241.56±0.46401.09±0.0281.51±0.18261.18±0.04411.11±0.0491.53±0.16271.19±0.08421.10±0.02101.28±0.16281.24±0.03441.08±0.03131.49±0.03291.27±0.04451.36±0.06142.21±0.20311.09±0.032.5分泌纤维素酶的能力（见图5）由图5可知，所有菌株均未能够产生水解圈。本试验所分离出来的芽孢杆菌不具备产纤维素酶能力。原因可能是所用的培养基的成分有差别。本试验所用的碳源是α-纤维素，两者分子结构方面有一定差别。但还需要进一步验证。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F005图5菌株21纤维素酶水解圈2.6菌株21对不同菌种生长的抑制圈（见图6）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F006图6菌株21对不同菌种生长的抑制圈（a） 葡萄球菌 （b） 沙门氏菌 （c） 大肠杆菌产蛋白酶、蛋白酶试验中筛选出具备很强的产蛋白酶和淀粉酶能力的5株菌株，编号为3、14、15、21、22，经抑菌试验，表明筛选的5株菌株对大肠杆菌、沙门氏菌的生长均具有一定的抑制能力，其中菌株21的抑菌圈最清晰最透亮，但对金黄色葡萄球菌的抑制能力稍微比较弱。2.7不同菌株对药物的敏感性（见图7）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F007图7不同菌株对药物的敏感性（a） 菌株3对药物敏感性 （b） 菌株14对药物敏感性试验选取3种抗生素，分别是红霉素、新霉素、丁胺卡那。结果显示，抑菌圈直径最大为31.0 mm，最小抑菌圈直径为14.0 mm。依据敏感性判断标准：抑菌圈直径（mm）介于0~10.1为耐药，介于10.1~15.0为中度敏感，介于15.1~20.0为高度敏感，大于20.0为极度敏感。分离菌株对3种抗生素均敏感，菌株3、14对药物的敏感性较强。2.8芽孢杆菌黏附能力（见表3、图8）益生菌的黏附能力是判定菌株是否能够成功定植机体肠道的关键因素之一，也是菌株定植肠道内能够发挥益生功效的前提。由表3可知，筛选的5株候选菌株对黏蛋白具有不同的黏附能力。由图8可知，菌株14和22具有相对较高的黏附能力，菌株15和21的黏附能力最弱。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.T003表3芽孢杆菌黏附能力菌株编号314152122黏附率0.1550.3570.0480.0630.227%图8不同菌株的黏附能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F8a1（a）菌株14黏附能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F8a2（c）菌株22黏附能力2.9菌株种属属性鉴定（见图9、图10）以候选菌株（菌株3、14、15、21、22）DNA为模板，进行16S rDNA基因PCR扩增，PCR扩增产物使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送测序。由图9可知，PCR扩增的条带大小约为1 500 bp，与目的条带相符。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F009图916S rDNA PCR产物电泳图注：1和2为菌株3，3和4为菌株14，5和6为菌株15，7和8为菌株21，9和10为菌株22，n为大肠杆菌，f为金黄色葡萄球菌。由图10可知，菌株3号的16S rDNA基因序列与解淀粉芽孢杆菌相似度最高，认为菌株3是解淀粉芽孢杆菌。菌株14为枯草芽孢杆菌，菌株15为枯草芽孢杆菌，菌株21为地衣芽孢杆菌，菌株22为枯草芽孢杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.017.F010图105株筛选菌株16S rDNA基因序列系统发育树分析3讨论试验所筛选的5株候选菌株经过人工胃液、人工肠液处理均对胃肠道微环境中的影响因子具有一定的耐受性。经产蛋白酶、淀粉酶试验，候选菌株具有一定的产消化酶的能力。经对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌这3种常见病原菌的抑菌试验结果表明，5株候选菌株均具有一定的抑菌能力。因此，本次筛选的菌株能够满足益生菌的一些基本要求。畜禽胃部的pH值相对较低，很多外源微生物在畜禽胃部被破坏。肠道内的胆盐浓度不是一个固定值，会随时间不断变化，小肠部位的胆盐浓度平均约为0.3%[15]。益生菌在畜禽肠道内定植、发挥作用需要具备一定的酸耐受性和胆盐耐受性。因此，本研究在体外对候选菌株进行胃液、肠液耐受性试验，结果表明，筛选的候选菌株均具有良好的胃液、肠液耐受性，说明候选菌株在动物体内不会被胃液和肠液消化，符合益生菌的标准之一。具备一定的产酶能力是评判益生菌的指标之一，蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，分为内肽酶和外肽酶。动物体内，蛋白酶能够促进动物机体对饲料中营养成分的消化吸收，提高动物的生产性能[16]。淀粉酶能够水解淀粉和糖原，在饲料中添加具有分泌淀粉酶功能的芽孢杆菌，可以将饲料中的淀粉成分水解为葡萄糖，提高畜禽对饲料中营养成分的利用率[17]。因此，应以产蛋白酶和淀粉酶能力强的菌株作为候选菌株。本试验前期初步筛选的菌株产酶能力差异较大，因此挑取5株产酶能力强的菌株（3、14、15、21、22）作为候选菌株进行下一步试验。除了产酶能力是益生菌的筛选的标准之一，抑菌能力在益生菌的筛选中也是必不可少的评判标准。肠道中常见的病原菌（如大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌）在日常的生产管理中均容易进入肠道，并在肠道内定植[18]，影响畜禽肠道内微生物群落、肠道稳态变化，降低机体抵御外界的能力[19-21]。本试验结果表明，分离的菌株对大肠杆菌、沙门氏菌的生长具有相对较强的抑制作用，符合试验预期。益生菌的黏附能力具有保证益生菌能够在肠道内定植、排斥病原菌、提高机体免疫能力等作用，也是益生菌发挥益生功效的基础[22]，细菌黏附能力可以作为衡量益生效果的重要指标之一。目前，通常采用间接评价法和直接测定法检测细菌的黏附性能力，直接测定法是通过体外构建模型的方法评定菌株对上皮细胞（如：HeLa、HT-29和Caco-2细胞）或黏蛋白的黏附情况。菌体与肠道上皮细胞之间存在一层黏液层，益生菌需要先黏附于黏液层，才能够畜禽肠道上皮细胞发生作用，引起免疫应答[23-25]。本试验采用体外黏蛋白模型测定5株候选菌株的黏附能力，结果显示，5株菌株的黏附特性具有一定的差异，菌株14和22具有相对较强的黏附能力。研究表明，细菌黏附主要是黏附素与特异受体间的相互作用，5株菌株黏附特性的差异可能与其表面黏附素结构组成不同有关。4结论挑选45株革兰氏阳性、产芽孢的菌株进行能力测试，45株菌株对人工胃液和人工肠液均有较强耐受性，5株菌株有较强产蛋白酶和淀粉酶的能力，对大肠杆菌、沙门氏菌的生长均具有一定的抑制能力，菌株21的抑菌能力最强。菌株14和22对黏蛋白具有相对较高的黏附能力；5株菌株有3株为枯草芽孢杆菌、1株为解淀粉芽孢杆菌、1株为地衣芽孢杆菌。