溶菌酶存在动物分泌液、禽蛋及部分细菌中，是动物机体中重要的非特异性免疫因子，具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[1]。鸡蛋清溶菌酶是目前研究与应用最多的溶菌酶之一[2-4]。溶菌酶二聚体是以蛋清溶菌酶（主要为单体99%）为原料，通过二聚化反应、制粒、干燥、过筛等工艺生产的溶菌酶二聚体（二聚体成分组成≥30%）颗粒。通过采用共价交联技术制备的溶菌酶二聚体保留溶菌酶单体的生物学特性[5-6]，具备非酶特性及免疫活性新特性，能够双向功能性调节免疫系统平衡，细胞因子水平上调节TNF、IL-2、IL-6、INF等的合成，改善动物健康[7-8]。溶菌酶二聚体的毒性明显低于单体[9]，结构稳定，能够较好地解决溶菌酶直接在饲料中应用的难题[10]。溶菌酶二聚体作为饲料添加剂可增强哺乳动物的生产性能和非特异性免疫功能[11]，改善仔猪肠道形态，提高仔猪非特异性免疫能力，促进仔猪生长；促进生长育肥猪增长，减少腹泻，提高生长育肥猪肉质品质[12]；可以提高母猪繁殖性能、免疫能力及母猪后代仔猪的抗病力[13]；调节鲤鱼的细胞免疫和体液免疫[14]；预防鱼类、蜜蜂疾病[15]；增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和杀伤活性[16]。溶菌酶二聚体作为饲料添加具有广阔的市场前景。本试验旨在考察饲料添加剂溶菌酶二聚体的性质在温度、湿度、光照等条件的影响下随时间变化的规律，为溶菌酶二聚体的生产、包装、贮存、运输条件和有效期的确定提供、产品的开发及推广提供参考。1材料与方法1.1试验材料溶菌酶二聚体样品购自上海艾魁英生物技术有限公司（二聚体含量≥30%，酶活力≥500 U/mg），样品批号为1101、1102、1103。1.2试验仪器AB135-S型电子天平购自美国梅特勒-托利多集团；DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司；pHS-25型pH计购自上海精科雷磁；EPS-300型电泳仪、Tanon-1600型全自动数码凝胶图像分析系统均购自上海天能科技有限公司；SHH-200GSD综合药品稳定性试验箱购自重庆市永生实验仪器厂。1.3考察项目根据农业农村部办公厅印发的《饲料添加剂稳定性试验指南（试行）》对饲料添加剂固体产品稳定性考察的建议项目，结合溶菌酶二聚体产品特性，确定对产品外观与性状、水分、二聚体含量及酶活力进行考察。根据产品质量标准，产品外观与性状为黄色或微黄色颗粒，水分≤10%，溶菌酶二聚体含量≥30%，溶菌酶酶活力≥500 U/mg。1.4测定指标及方法1.4.1水分溶菌酶二聚体水分按照GB/T 6435—2014《饲料中水分的测定》。精密称取样品5 g于称量瓶，103 ℃干燥（4.0±0.1）h，称重，计算水分。1.4.2二聚体含量参考凝胶电泳法测定溶菌酶二聚体含量[17-19]，使用4%~15%小型预制胶，上样量为10 μL，电泳条件为15 mA恒电流；使用马斯亮蓝蛋白胶快速染色液进行染色，纯水脱色至背景无色后扫描条带，分析二聚体含量。1.4.3酶活测定1.4.3.1样品制备精密称定样品0.12 g置于烧杯中，加入0.1 mol/L、pH值6.6、100 mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，磁力搅拌约4 h使其溶解。1.4.3.2底物制备称取溶壁微球菌干粉22.5 mg，加入pH值6.2、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液至70 mL，轻轻摇动制成菌悬液。使用前将该溶液置于37 ℃孵育30 min。以pH值6.2、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液进行调零，测该溶液的吸光值，使其在450 nm波长处的读数在0.70~0.80范围，制备底物溶液。1.4.3.3样品酶活测定25 ℃精确移取2.9 mL底物溶液于比色皿，测定吸光值。3 min内初始吸光度值变化应≤0.003时，即可以开始测定。向比色皿中继续加入0.1 mL待测样品溶液，使其充分混合。每30 s记录1次吸光度值，连续测定6次，每分钟吸光度值变化范围应在0.03~0.08。X=A1-A22×m×0.001 (1)式中：X为溶菌酶二聚体的酶活力（U/mg）；A1为试样在450 nm处反应1 min 时的吸光度；A2为试样在450 nm处反应3 min时的吸光度；2为获得1 min和3 min吸光度读数所用的时间（min）；m为用于分析的试样制备溶液中的溶菌酶二聚体质量（mg）；0.001为由单位溶菌酶二聚体每分钟引起的吸光度降低的值。1.5影响因素试验1.5.1高温试验称取样品50 g，平铺于直径为15 cm的培养皿，将培养皿置于综合药品稳定性试验箱内，60 ℃放置10 d，分别于第0、5、10 d取样检测考察指标。1.5.2高湿试验称取样品50 g，平铺于直径为15 cm的培养皿，将培养皿置于综合药品稳定性试验箱内，25 ℃ RH (90±5)％条件下放置10 d，分别于第0、5、10 d取样检测考察指标。1.5.3光照试验称取样品50 g，平铺于直径为15 cm的培养皿，将培养皿置于综合药品稳定性试验箱内，在照度（4 500±500）Lx条件下放置10 d，分别于第0、5、10 d取样检测考察指标。1.6加速试验取3批溶菌酶二聚体样品，模拟上市包装，于 (40±2) ℃、RH (75±5)％条件下放置6个月，分别于第0、1、2、3、6月末取样检测考察指标。1.7长期试验取3批溶菌酶二聚体样品，模拟上市包装，于温度(25±2) ℃ RH (60±10)％条件下放置，分别于第0、3、6、9、12、18月末取样检测考察指标。1.8产品有效期预测根据溶菌酶二聚体酶活力变化计算，按照长期试验测定数值，以标示量（%）对时间进行直线回归，得回归方程，求出各时间点标示量的计算值（y'），计算标示量（y'）95%单侧可信限的置信区间：y'±z，其中z=tn-2·S[1/N+（X0-X）2/Σ（Xi-X'）2]1/2，将各有关点连接可得出分布于回归线两侧的曲线。取溶菌酶二聚体酶活力含量低限90%与置信区间下限线相交点对应的时间，为有效期。1.9数据统计与分析试验数据采用Excel软件整理与分析，绘制回归曲线。2结果与分析2.1溶菌酶二聚体影响因素试验（见表1）由表1可知，溶菌酶二聚体样品经高温、高湿、光照试验，外观与性状为浅黄色颗粒状，水分、溶菌酶二聚体含量、酶活力符合产品质量标准，未发生显著变化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.018.T001表1溶菌酶二聚体影响因素试验时间/d高温试验高湿试验光照试验水分/%二聚体/%酶活力/(U/mg)水分/%二聚体/%酶活力/(U/mg)吸湿增重/%水分/%二聚体/%酶活力/(U/mg)08.530.9551.08.530.9551.008.530.9551.058.630.6539.08.630.5527.01.88.730.6530.0109.130.4511.08.730.2504.02.38.730.2518.0高湿试验结果表明，溶菌酶二聚体吸湿增重≤5%，符合《饲料添加剂稳定性试验指南（试行）》的要求。2.2溶菌酶二聚体加速试验（见表2）由表2可知，溶菌酶二聚体样品经加速试验，外观与性状为浅黄色颗粒状，未发生明显变化。水分、溶菌酶二聚体含量、酶活力均符合产品质量标准，未发生显著变化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.018.T002表2溶菌酶二聚体加速试验批号时间/月水分/%二聚体含量/%酶活力/(U/mg)110108.530.9560.018.730.6551.029.230.1539.039.530.1524.069.730.0507.0110208.030.6547.018.330.4542.028.630.3535.039.130.2522.069.430.1513.0110308.330.5553.018.530.3540.029.230.3529.039.530.2518.069.530.1502.02.3溶菌酶二聚体长期试验（见表3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.018.T003表3溶菌酶二聚体长期试验批号时间/月水分/%二聚体含量/%酶活力/(U/mg)110108.530.9553.038.730.7547.068.930.3533.098.930.3519.0129.330.1504.0189.530.1503.0110208.030.6560.038.230.5551.068.430.4543.098.930.3524.0129.330.3511.0189.630.1509.0110308.330.5558.038.530.5544.068.730.4537.099.030.3520.0129.430.2504.0189.830.1502.0溶菌酶二聚体样品经长期试验后，外观与性状为浅黄色颗粒状，未发生明显变化。水分、溶菌酶二聚体含量、酶活力均符合产品质量标准，未发生显著变化。2.4溶菌酶二聚体酶活力与时间变化曲线（见图1）由图1可知，1101批号溶菌酶二聚体酶活力与时间变化曲线，含量低限与置信区间下限线相交点对应的时间大于24个月，1102及1103两批样品预测的有效期均大于24个月。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.018.F001图1溶菌酶二聚体酶活力与时间变化曲线3讨论稳定性试验目的是考察饲料添加剂的性质在温度、光照、光照等条件的影响下随时间变化的规律，为饲料添加剂的生产、包装、贮存、运输条件和有效期的确定提供参考，以确保上市饲料添加剂安全有效。加速试验[20]是在超常条件下进行的，目的是通过加快饲料添加剂的化学或物理性质变化速度考察其稳定性，对饲料添加剂在运输、储存过程中可能会遇到的短暂超常条件下的稳定性进行模拟考察。3.1贮存条件的确定试验结果显示，影响因素试验高温60 ℃、高湿RH(90±5) ％、光照（4 500±500）Lx条件，溶菌酶二聚体5、10与0 d相比，颜色、性状、含量、水分等各指标均无明显变化，说明溶菌酶二聚体对光、热、湿稳定；加速试验中，溶菌酶二聚体颜色、性状、含量、水分等各指标均也无明显变化，表明溶菌酶二聚体稳定性良好。综合影响因素试验、加速试验和长期试验的结果，结合溶菌酶二聚体在流通过程中可能遇到的操作不当、极端天气等情况综合分析，选定的贮存条件为干燥、通风处。3.2包装材料的确定根据影响因素试验，初步确定包装材料为复合纸袋；对溶菌酶二聚体进行模拟上市包装后进行加速试验和长期试验，根据试验结果，验证包材可保证样品的稳定性，确定产品的最终包装为复合纸袋。3.3有效期的确定3批溶菌酶二聚体样品经18个月的长期试验，统计分析，预测的有效期分别均大于24个月，考虑到流通环节及贮存条件可能遇到的问题，确定本产品的有效期为12个月。产品开封后应尽量用完，一次不能用完应密闭置于干燥通风处。4结论溶菌酶二聚体在影响因素试验、加速试验和长期试验中均比较稳定。确定产品的包装为复合纸袋，选定的贮存条件为干燥、通风处。经有效期预测分析，初步确定本产品的有效期为12个月。