新疆是我国最重要的产棉地区[1]，棉花生产是新疆重要的支柱产业，垦区是新疆兵团重要的棉花种植区，每年种植棉花约17.5万hm2，约占农作物播种面积的73.42%，年产生棉花秸秆约870.5万t[2]。近年来，由于草食畜牧业的快速发展，粗饲料资源短缺问题增加，棉产品粗蛋白含量高，其粗蛋白含量仅次于豆粕，是优质的蛋白资源且价格低廉[3]。因此，棉产品是新疆畜牧业的主要粗饲料资源，能够为牛羊养殖提供大量的优质低廉饲草。棉产品中的游离棉酚是一种毒性较大的抗营养物质，当棉酚含量过多时会导致畜禽中毒、发育迟缓和繁殖率下降[4]。游离棉酚具有一定蓄积作用，游离棉酚达到一定含量可使动物中毒[5-6]。游离棉酚可与蛋白质和铁结合，具有损害血红蛋白中铁的作用，引起畜禽的缺铁性贫血[7]。Kenar[8]研究发现，棉酚具有抗生育功能，能够降低精子的成活率。棉酚作为新型非常规饲料资源对弥补饲料资源短缺具有发展意义[9]。因此，测定棉产品中游离棉酚极为重要。目前国内外常使用的游离棉酚测定方法为间苯三酚法[10]、苯胺法[11]和高效液相色谱法[12-13]。苯胺法测定快速方便但使用试剂毒性大、不稳定。研究发现，通过添加硝酸亚铁能够降低棉产品中棉酚含量[14]。姜晓瑞等[15]通过对比炒、醋炙和蒸技前处理方法中棉产品中棉酚含量，筛选出能够降低棉酚含量的炮制方法。文章采用间苯三酚法和高效液相色谱法测定棉产品中棉酚含量，筛选出准确快捷的检测方法。通过相同粉碎粒度处理下测定不同干燥温度的棉产品中棉酚含量的变化，确定能够降低棉产品中游离棉酚含量的烘干温度。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验样品将3种来源和棉酚含量不同的棉粕、棉籽壳、棉蛋白（新疆阿克苏地区天康生物）分别标记为样1、样2和样3，粉碎，过40目筛。1.1.2试验仪器BATHS HH-S 2数显恒温水浴锅、普析TU-1810紫外可见分光光度计、高效液相色谱仪Waters e 2659 Separations Module、TU1/KARDEX WATO 54275、泰斯特恒温培养摇床ＴY-R70B。1.1.3试验试剂棉酚对照品、浓盐酸、丙酮、间苯三酚、95%乙醇、乙腈、磷酸。1.1.4试验场地试验于塔里木大学兵团畜牧重点实验室、塔里木大学生物研发中心综合检测室进行。1.2试验设计采用间苯三酚法和高效液相色谱法测定样1、样2和样3中的游离棉酚含量，比较回收率确定准确测定游离棉酚含量的方法。设置65、75、85、95、105 ℃和未烘干温度，测定不同烘干温度下样1、样2和样3中的游离棉酚含量变化。1.3测定指标及方法1.3.1间苯三酚法棉酚标准溶液的配制称取0.050 0 g棉酚对照品，使用70%丙酮溶液定容至50 mL容量瓶，100 mg/L游离棉酚工作液作为母液，移取1 mL母液，使用70%丙酮水溶液稀释，定容至50 mL，得到工作液。1.3.2显色剂称取1.000 0 g间苯三酚，溶于16.6 mL浓盐酸，使用95%乙醇定容至100 mL，摇匀，转入棕色瓶，至于4 ℃冰箱保存。1.3.3游离棉酚标准曲线绘制准确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL游离棉酚工作液，依次加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL 70%丙酮，加入2 mL显色剂，摇匀，50~55 ℃水浴加热5 min，将该溶液转入1 cm比色皿，加入0 mL游离棉酚工作液、1 mL70%丙酮、2 mL显色剂的溶液调零，在550 nm测定吸光值。不同浓度棉酚标准液吸光度见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.025.T001表1不同浓度棉酚标准液吸光度浓度/(g/L)棉酚含量/(mg/L)吸光度0000.2200.186 50.4400.372 90.6600.575 90.8800.763 21.01000.933 3根据棉酚含量和吸光度值进行回归计算，得到回归方程y=106.02x-0.036 4（R2=0.999 6)，绘制标准曲线，棉酚标准曲线见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.025.F001图1棉酚标准曲线1.3.4样品测定称取5.000 0 g样1、样2和样3分别于65、75、85、95和105 ℃烘干4 h，将烘干样和未烘干样1、2和3精确称取1.000 0 g样品于锥形瓶，每个样品3组重复；各样品分别加入15 mL 70%丙酮溶液，瓶口密封，气浴振荡器39 ℃ 120 r/min振荡1 h，使用中速滤纸过滤于50 mL容量瓶，70%丙酮溶液洗涤并定容。移取1 mL滤液于10 mL试管，分别加入2 mL显色剂，摇匀，按标准曲线绘制步骤测定滤液棉酚含量。1.3.5回收率测定分别称取0.500 0 g的样1、样2和样3于50 mL三角瓶，各加入100 mg/L棉酚标准溶液3.5 mL。按样品测定方法处理，测定滤液吸光度，计算棉酚回收率。回收率(%)=(加标样测定量－样品棉酚量)/加入的棉标量×100%(1)1.3.6高效液相色谱法色谱条件色谱柱：WATO-54275 water-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.2%磷酸水（85∶15），流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长235 nm。1.3.7棉酚标准溶液制备精确称取棉酚对照品2.29 mg，加流动相乙腈-0.2%磷酸水（85∶15）定容至25 mL容量瓶，吸取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL试管，依次加入4.00、3.00、2.00、1.00、0 mL流动相定容。进样20 μL。标准棉酚色谱见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.025.F002图2标准棉酚色谱1.3.8样品测定称取样品约0.150 0 g，加入10 mL丙酮，超声波提取15 min，3 000 r/min离心10 min，吸取上层清液，使用丙酮对余下残渣提取2次，每次10 mL丙酮，超声10 min，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，将3次上清液合并，减压抽干，余下残渣使用流动相定容50 mL容量瓶，使用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，滤液作为供试品溶液20 μL进样。1.3.9回收率试验精密称取每种棉副产品3份，每份样品约1.000 0 g，分别加入100 mg/L棉酚对照品3.5 mL，按样品检测方法进行测定。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较检验。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1间苯三酚法和高效液相色谱法测定棉产品中游离棉酚的含量（见图3~图5、表2~表3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.025.F003图3棉粕中棉酚色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.025.F004图4棉籽壳中棉酚色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.025.F005图5棉蛋白中棉酚色谱图由表2可知，间苯三酚法，棉蛋白中游离棉酚的含量是188.34 mg/kg；棉粕中游离棉酚的含量是582.20 mg/kg；棉籽壳中游离棉酚的含量是265.73 mg/kg。高效液相色谱法，棉蛋白中游离棉酚的含量是175.05 mg/kg；棉粕中游离棉酚的含量是557.18 mg/kg；棉籽壳中游离棉酚的含量是239.55 mg/kg。间苯三酚法测定的棉蛋白、棉粕和棉籽壳中游离棉酚含量均显著高于效液相色谱法（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.025.T002表2间苯三酚法和高效液相色谱法测定样品中游离棉酚含量样品间苯三酚法高效液相色谱法棉蛋白188.34±1.90a175.05±3.99b棉粕582.20±4.02a557.18±8.21b棉籽壳265.73±1.96a239.55±3.56b注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mg/kg由表3可知，间苯三酚法，加标棉蛋白中游离棉酚的含量是533.87 mg/kg，回收率为98.87%；加标棉粕中游离棉酚的含量是912.56 mg/kg，回收率为95.52%；加标棉籽壳中游离棉酚的含量是595.82 mg/kg，回收率为90.75%。高效液相色谱法，加标棉蛋白中游离棉酚的含量是516.65 mg/kg，回收率为97.60%；加标棉粕中游离棉酚的含量是872.74 mg/kg，回收率为90.16%；加标棉籽壳中游离棉酚的含量是562.89 mg/kg，回收率为92.38%。使用间苯三酚法测定棉蛋白、棉粕和棉籽壳中加标样游离棉酚含量均显著高于高效液相色谱法（P0.05）。两种方法测得回收率均超过90%，但间苯三酚法测定的3种样品的回收率均高于高效液相色谱法且更接近100%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.025.T003表3间苯三酚法和高效液相色谱法测定样品加标回收率样品间苯三酚法高效液相色谱法含量/(mg/kg)回收率/%含量/(mg/kg)回收率/%棉蛋白533.87±0.36a98.87516.65±2.68b97.60棉粕912.56±2.29a95.52872.74±1.42b90.16棉籽壳595.82±5.05a90.75562.89±2.54b92.382.2不同干燥处理对棉产品中棉酚含量的影响（见表4）由表4可知，随烘干温度升高，棉籽壳、棉粕和棉蛋白中游离棉酚含量呈下降趋势。间苯三酚法测定未烘干、65、75、85、95和105 ℃处理下棉蛋白中游离棉酚含量分别是188.34、188.54、186.90、183.40、180.65和180.12 mg/kg；未烘干处理与65 ℃烘干处理下棉蛋白中的游离棉酚含量差异不显著（P0.05）；未烘干组处理下棉蛋白中的游离棉酚含量显著高于75、85、95、105 ℃烘干（P0.05）；95 ℃处理与105 ℃烘干处理下棉蛋白中的游离棉酚含量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.025.T004表4不同干燥处理对棉产品中棉酚含量的影响组别游离棉酚/(mg/kg)棉蛋白棉粕棉籽壳未烘干组188.34±1.42a582.20±0.76a265.73±1.09a65 ℃烘干组188.54±1.06a581.76±1.35a273.52±1.12a75 ℃烘干组186.90±0.93b580.97±0.89a268.75±1.36a85 ℃烘干组183.40±0.74c577.55±1.52b265.28±0.72b95 ℃烘干组180.65±0.69d576.08±0.26c258.55±1.14c105 ℃烘干组180.12±0.99d576.45±1.43c258.42±0.96c注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表 示差异不显著（P0.05）。间苯三酚法测定未烘干、65、75、85、95和105 ℃处理下棉粕中游离棉酚含量分别是582.20、581.76、580.97、577.55、576.08和576.45 mg/kg；未烘干组与65、75 ℃烘干处理下棉粕中的游离棉酚含量差异不显著（P0.05）；未烘干组棉粕中的游离棉酚含量显著高于85、95、105 ℃烘干处理（P0.05）；95 ℃烘干处理与105 ℃烘干处理下棉粕中的游离棉酚含量差异不显著（P0.05）。间苯三酚法测定未烘干、65、75、85、95和105 ℃处理下棉籽壳中游离棉酚含量分别是265.73、273.52、268.75、265.28、258.55和258.42 mg/kg；未烘干处理与65、75 ℃烘干处理下棉籽壳中的游离棉酚含量差异不显著（P0.05）；未烘干处理组棉籽壳中的游离棉酚含量显著高于85、95、105 ℃烘干处理（P0.05）；95 ℃烘干处理与105 ℃烘干处理与下棉籽壳中的游离棉酚含量差异不显著（P0.05）。3讨论3.1间苯三酚法和高效液相色谱法测定棉产品中游离棉酚的含量棉酚又称棉籽醇，是一种黄色复杂的多羟基双萘醛类化合物。崔银仓等[16]认为，游离棉酚被吸收并在人和动物体内蓄积，对人畜机体的神经、生殖系统、心脏、肝肾均有毒害作用，间接或直接地危害机体健康。因此，对游离棉酚的检测越来越重视，已报道的检测游离棉酚含量的方法有很多。沈静等[17]使用薄层色谱法测定棉油中棉酚含量，结果发现，需要至少3次展开才能够充分利用薄层板，其精确性存在问题。Veda等[18]认为，高效液相色谱法是一种准确快捷测定棉酚的方法。施琦贻[19]报道，以高效液相色谱-串联质谱技术联用技术检测蛋黄中残留的棉酚，采用电喷雾负离子模式离子化、多反应监测模式测定棉酚，但方法相对复杂。Waiss等[20]提出，核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）提取棉花花蕾中的棉酚，但因仪器昂贵试验复杂，精准度低等被其他方法代替。李建凡等[21]提出，可使用比色法测定棉籽粕中棉酚含量，但此方法所提出的振荡时间并不能使棉酚完全浸提。郑清梅[22]采用间苯三酚法测定棉酚，认为超声振荡1 h时测定棉酚更稳定，故本试验超声振荡选定1 h。苯胺比色法是国标方法，朱利民等[23]通过比较苯胺比色法和间苯三酚法，认为间苯三酚法测定棉酚更加准确。景伟文等[24]认为，高效液相色谱法比苯胺比色法更适合测定棉叶中棉酚含量。本试验中，从间苯三酚法和高效液相色谱法测定饲料中游离棉酚含量的测定结果趋于一致；根据两种方法的回收率，间苯三酚法和高效液相色谱法的回收率均在误差范围内，间苯三酚法和高效液相色谱法均为稳定测定棉酚的方法，但间苯三酚法比高效液相色谱法操作简便、快速且易于掌握。间苯三酚法是一种精确度可以满足工业化测定棉产品中游离棉酚的高效检测方法。3.2不同干燥处理对棉产品中棉酚含量的影响棉酚化学性质不稳定，具有高温易氧化的特性[25]，Marciniak等[26]研究表明，棉酚见光易分解，高强度光辐射会影响棉产品中游离棉酚的含量。棉产品长时间堆放后产生单菌或混合菌发酵后降低游离棉酚含量[27-28]，造成棉产品中游离棉酚的流失，实际饲养过程中无法准确计算游离棉酚的含量。任慧玲等[29]研究发现，不同粉碎粒度影响游离棉酚含量，1.4 mm孔筛比2.8 mm孔筛下棉籽蛋白的游离棉酚含量高。相同粉碎粒度下棉产品中游离棉酚含量趋于稳定。曲连发等[30]研究表明，不同湿度对棉产品中游离棉酚含量影响并不显著，但随温度升高游离棉酚含量降低，棉产品的温度影响棉产品中游离棉酚的含量。本文探究不同烘干温度对棉产品中棉酚含量的影响，结果显示，65 ℃烘干和未烘干状态下的棉酚含量近似，85、95和105 ℃烘干处理比75 ℃烘干和未烘干处理的棉产品中棉酚含量显著降低。随烘干温度升高，棉酚含量逐渐下降。65 ℃烘干处理的棉产品可保障棉产品中游离棉酚的稳定。4结论间苯三酚法是比高效液相色谱法更快捷操作简单检测游离棉酚的方法。不同烘干温度影响棉产品中游离棉酚的含量。随烘干温度的增加游离棉酚含量降低，65 ℃烘干处理下的棉产品的游离棉酚含量稳定。