丁酸梭菌（Clostridium butyricum）可以在健康的畜禽肠道中定植，能够产生乳酸和丁酸等短链脂肪酸[1]，益于肠道健康。欧盟批准丁酸梭菌可以作为饲料添加剂应用在畜禽生产中，生物酶制剂和益生菌可以替代抗生素在动物生产中使用[2-3]。丁酸梭菌具有耐热（常温下易保存）、耐胃酸、耐胆盐等抗逆性[4]，能够在肠道厌氧环境下生长，产生丁酸等短链脂肪酸，调节肠道健康[5]。丁酸梭菌在繁殖过程中产生的丁酸可以为动物的肠壁供能，在肠道定植过程中分泌的消化酶和益生菌可以提高日粮消化率，改善肠道菌群结构，降低幼龄动物腹泻率[6]。研究表明，在犊牛的日粮中添加2.0×108 CFU/kg的丁酸梭菌可以有效提高犊牛断奶期的生长性能和机体免疫力，降低腹泻率，提高犊牛的生长性能。在仔猪日粮中添加丁酸梭菌可以降低断奶仔猪腹泻率，显著提高断奶仔猪饲料利用率[7-9]。丁酸梭菌在猪、鸡等单胃动物中的研究较多，但在反刍动物生产中的研究较少。本试验通过在肉牛日粮中添加丁酸梭菌，探究丁酸梭菌对肉牛营养物质表观消化率、生长性能、粪便微生物组成和血清生化指标的影响，为丁酸梭菌剂在生长期和育肥期肉牛生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料与试验设计试验所用丁酸梭菌购自广东溢多利生物科技股份有限公司，活菌数≥1.0×109 CFU/g。试验地点为广东溢多利生物科技股份有限公司动物试验基地。选取40头初重为（335±25）kg的西门塔尔牛♂×秦川牛♀杂交肉牛的公牛，随机分为2组，每组20个重复，每个重复1头牛。对照组肉牛饲喂基础日粮，丁酸梭菌组在基础日粮中添加20g/(头·d）的丁酸梭菌。预试期7 d，正式试验期60 d。试验日粮由精料和粗料组成，粗料为玉米青贮，精料提前配制，以精粗比6∶4的比例混合成TMR日粮饲喂。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.003.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米28.68粗蛋白/%12.20麸皮8.16中性洗涤纤维/%61.06豆粕9.66酸性洗涤纤维/%31.60DDGS10.92钙/%0.56小苏打0.54磷/%0.33石粉0.66消化能/(MJ/kg)8.06食盐0.30预混料1.08玉米青贮40.00注：1.每千克预混料为日粮提供：Cu 300~875 mg、Fe 4 000~8 250 mg、Zn 1 000~1 875 mg、Mn 1 000~3 000 mg、Se 2.5~12.5 mg、I 25~125 mg、Ca 10~20 mg、NaCl 8.25~12.5 mg、总磷≥1 mg、VA 40~200 mg、VD3 20~100 mg、VE ≥200 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.2饲养管理试验牛拴系舍饲，自然通风，统一饲养管理，试验前对肉牛进行驱虫，消毒方案按照基地正常方案进行。每天8：00和16：00饲喂2次，试验牛自由采食、饮水，保证有3%~5%的剩料，每日清理圈舍。1.3测定指标及方法1.3.1营养物质表观消化率在试验中期采集肉牛瘤胃液进行体外饲料消化代谢试验，使用瘤胃导管通过牛的口腔将瘤胃液取出，将取出的瘤胃液与缓冲液。按照1∶1比例配成发酵液，倒入体外消化培养液瓶中。缓冲液的配置方法见表2。称取0.500 0 g饲料样品于体外消化培养过滤袋（美国ANKOM技术公司）中，分为添加丁酸梭菌组和不添加对照组，添加量为干物质含量的0.25%。密封，置于体外消化培养管中，倒入70 mL发酵液，充入二氧化碳，盖上橡胶塞，保持隔绝氧气状态。将其置于水浴恒温振荡器（苏州培英DSHZ-300）中，保持39 ℃，50 r/min，在24 h和48 h的时间段分别取样，冲洗干净过滤袋，于105 ℃的烘箱中烘4 h，剪开过滤袋计算干物质（DM）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）于24 h和48 h的表观消化率；另每组取3个重复样单独测定粗蛋白（CP）的表观消化率。营养物质表观消化率=[放入培养管中样品营养成分－(发酵残渣中的营养成分－空白对照)]/放入培养管中样品营养成分×100%(1)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.003.T002表2缓冲液配置方法试剂浓度/(g/L)碳酸氢钠（NaHCO3）9.80磷酸氢二钠（Na2HPO4·H2O）9.30氯化钠（NaCl）0.47氯化钾（KCl）0.57尿素（Urea）1.00氯化钙（CaCl2）0.04氯化镁（MgCl2）0.061.3.2生长性能在试验进行的第0、30和60 d对牛进行称重，计算总增重和平均日增重，记录试验期内每头牛的干物质采食量，计算料重比。平均日增重=试验期总增重/试验天数（2）平均日采食量=消耗日粮/(试验天数×试验牛数)（3）料重比=平均干物质采食量/平均日增重（4）1.3.3粪便微生物数量在称重当天于晨饲前收集每头牛的粪便于单独的桶中，混匀，取200 g置于密封袋，测定粪便中微生物数量。使用海博生物技术有限公司生产的亚希酸盐胱氨酸增菌液、亚硫酸铁多黏菌素B琼脂、结晶紫中性胆盐琼脂培养基、MRS乳酸细菌培养基进行粪便中微生物（沙门氏菌、梭菌、大肠杆菌、乳酸菌）培养和数量的测定。大肠杆菌数量的测定参考GB/T 18869—2019；沙门氏菌数量的测定参考GB/T 13091—2002；梭菌数量的测定参考GB/T 4789.35—2016；乳酸菌数量的测定参考GB/T 4789.35—2016[10]。1.3.4血清生化指标在试验结束当天晨饲前，使用5 mL含有肝素钠抗凝剂的采血管对每头牛颈动脉采血，3 000 r/min离心15 min，吸取上层血清，转移至1.5 mL的离心管，液氮速冻，-20 ℃保存，使用科华卓越450全自动生化分析仪测定总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、葡萄糖（GLU）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、尿素氮（BUN）含量及谷丙转氨酶（ALT）活性。1.4数据统计与分析数据采用Excel 2007整理，SPSS 24进行方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1丁酸梭菌对肉牛营养物质表观消化率的影响（见表3）由表3可知，在体外消化试验中，24 h时，丁酸梭菌组肉牛的粗蛋白质表观消化率极显著低于对照组（P0.01）；在48 h时，丁酸梭菌组肉牛的干物质表观消化率显著高于对照组（P0.05）；其他营养成分的表观消化率差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.003.T003表3丁酸梭菌对肉牛营养物质表观消化率的影响项目干物质粗蛋白中性洗涤纤维酸性洗涤纤维24 h48 h24 h48 h24 h48 h24 h48 hP值0.8090.0160.0050.3550.9280.8040.8560.321对照组41.04±1.7248.03±1.20b28.58±1.37A25.18±8.0760.71±4.9473.06±1.8657.17±4.1469.49±1.21丁酸梭菌组41.24±0.9150.27±1.47a15.68±2.17B31.45±8.0860.39±3.4270.90±10.5857.70±2.6572.28±3.04注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.2丁酸梭菌对肉牛生长性能的影响（见表4）由表4可知，丁酸梭菌组肉牛的干物质采食量显著高于对照组（P0.05）；平均日增重和料重比与对照组相比差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.003.T004表4丁酸梭菌对肉牛生长性能的影响项目0 d体重/kg30 d体重/kg60 d体重/kg平均日增重/[kg/(头·d)]干物质采食量/[kg/(头·d)]料重比P值0.5790.5670.7980.4140.0410.239对照组334.00±28.46398.08±23.35415.83±27.051.34±0.088.77±0.21b6.54±0.33丁酸梭菌组335.42±23.07390.33±21.98419.50±20.911.41±0.188.94±0.10a6.34±0.212.3丁酸梭菌对肉牛粪便微生物组成的影响（见表5）由表5可知，丁酸梭菌组肉牛粪便中大肠杆菌数量显著低于对照组（P0.05）；乳酸菌数量极显著高于对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.003.T005表5丁酸梭菌对肉牛粪便微生物组成的影响项目沙门氏菌/(×102 CFU/g)大肠杆菌/(×102 CFU/g)梭菌/(×102 CFU/g)乳酸菌/(×104 CFU/g)P值0.4510.0220.4250.001对照组83.40±58.07331.03±196.38a184.17±102.85213.50±54.23B丁酸梭菌组58.40±40.1366.68±41.12b309.00±351.81377.17±60.36A2.4丁酸梭菌对肉牛血清生化指标的影响（见表6）由表6可知，丁酸梭菌组肉牛血清中的总蛋白含量和谷丙转氨酶活性均显著高于对照组（P0.05）；血清中的白蛋白、尿素氮、葡萄糖、甘油三酯和总胆固醇含量与对照组相比差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.003.T006表6丁酸梭菌对肉牛血清生化指标的影响项目总蛋白/(g/L)白蛋白/(g/L)尿素氮/(mmol/L)葡萄糖/(mmol/L)甘油三酯/(mmol/L)总胆固醇/(mmol/L)谷丙转氨酶/(U/L)P值0.0400.5900.3100.1500.4700.7900.020对照组71.77±2.14b28.23±0.794.73±0.254.09±0.130.24±0.052.67±0.1630.71±1.64b丁酸梭菌组73.75±1.92a28.42±0.764.85±0.264.29±0.400.22±0.042.64±0.3533.85±3.50a3讨论3.1丁酸梭菌对肉牛营养物质表观消化率的影响丁酸梭菌在动物体内进行定植和繁殖的过程中可以产生多种酶，如淀粉酶、蛋白酶和果胶酶，这些酶可以将淀粉等碳水化合物分解为VFA，将蛋白和果胶分解为SCFA，从而提高饲料转化率[11]。Yang等[12]在肉仔鸡日粮中添加不同浓度的丁酸梭菌制剂，发现丁酸梭菌可以显著提高肉仔鸡的饲料转化率和平均日增重，提高小肠中消化酶的活性，促进糖代谢、脂肪代谢等生命活动[13]。本试验结果发现，24 h肉牛的干物质表观消化率两组间无明显差别，在48 h丁酸梭菌组肉牛的干物质表观消化率显著高于对照组。因此添加丁酸梭菌可以促进对饲料的消化，但需要丁酸梭菌在瘤胃内复苏成熟后发挥作用，时间约为18 h[14]。本试验中，对照组肉牛的蛋白质表观消化率在24 h极显著高于丁酸梭菌组，48 h时两组间无明显差异，与丁酸梭菌的复苏时间有关。NDF、ADF表观消化率在24 h和48 h时均无差异。由于丁酸梭菌在增殖的过程中可以产生淀粉酶、果胶酶等消化酶，可以起到分解营养物质、辅助宿主消化吸收的作用[5]。因此，在本试验肉牛的总干物质消化率显著提高的前提下，可能是造成饲料中的淀粉、果胶等营养物质会被进一步消化吸收的原因。3.2丁酸梭菌对肉牛生长性能的影响丁酸梭菌是一种广泛在动物生产中应用的新型微生态活菌制剂，可以改善畜禽肠道菌群，促进肠道健康[15]。李玉鹏等[16]在使用丁酸梭菌探索对断奶仔猪的生长性能，肠道功能等指标的影响时发现，丁酸梭菌能够显著断奶仔猪的平均日增重，料重比有降低的趋势，即在幼龄动物上应用可以促进营养物质的利用率。刘亭婷等[17]研究发现，在蛋用仔公鸡的基础日粮中添加丁酸梭菌能够显著减少盲肠中的大肠杆菌数，显著提高盲肠中乳酸菌数量，显著增加肠道各阶段的绒毛高度。本试验在生长期肉牛的日粮中添加丁酸梭菌，肉牛的平均日增重明显提高。丁酸梭菌在肉牛体内产生的多种消化酶和氨基酸等生物活性物质能够提高对肉牛饲料的消化利用率，补充肉牛生长所需要的各种养分和微量元素。丁酸梭菌本身作为肉牛体内的正常菌群，产生的丁酸是肠道上皮细胞修复和生长所需要的供能物质，在瘤胃中日粮的淀粉被分解成为挥发性脂肪酸，能够分解淀粉的物质源于瘤胃中的α-淀粉酶，丁酸梭菌能够产生高效的α-淀粉酶，促进淀粉的消化吸收[18]。因此，在日粮中添加丁酸梭菌可以提高淀粉在胃肠道中的利用效率。在犊牛等幼龄动物的生产中，丁酸梭菌能够有效地缓解因断奶和环境变化引起的腹泻和应激，减少药物和人工成本投入。本试验中，丁酸梭菌组肉牛干物质采食量显著提高，料重比显著降低，可能是丁酸梭菌在肉牛肠道中定植的过程中产生的淀粉酶、纤维素酶等消化酶提高了肉牛饲料的消化利用率和肠道蠕动，从而提高了肉牛的干物质采食量。3.3丁酸梭菌对肉牛粪便微生物组成的影响研究表明，断奶仔猪日粮中添加丁酸梭菌能够显著提高粪便中巨型球菌数量，抑制除霍氏真杆菌之外的梭菌生长[19]。乳酸利用菌主要为巨型球菌和反刍兽新月单胞菌，在反刍动物的瘤胃内巨型球菌可以分解利用瘤胃内60%~80%的乳酸，产生更易被吸收的丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，降低乳酸沉积，减少和缓解因大量食入碳水化合物等能量饲料时引发的瘤胃酸中毒[20-21]。王远霞等[22]在探索丁酸梭菌对断奶仔猪空肠菌群组成影响时发现，日粮中添加500和2 000 mg/kg丁酸梭菌可显著降低断奶仔猪肠杆菌科和大肠杆菌的相对丰度，提高布劳特氏菌属和瘤胃球菌属等有益菌的相对丰度，肠道中的有益菌群多样性和丰度越高，各菌群之间的协同依赖性越强，在受到外界的刺激时，可以保持肠道的相对稳态。谢树贵等[23]研究发现，B1丁酸菌株可产生抗菌肽如丁酸菌素，能够有效抑制大肠杆菌（K88株、K99株）、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长繁殖，在围产期奶牛的日粮中添加丁酸梭菌菌株，与特定的蛋白相结合能够显著提升外周淋巴细胞中的CD4+T细胞的总量，GP120通过促进CD4+T细胞产生IL-10，降低有害菌的增殖，从而抑制肠道炎症[24]，且丁酸梭菌产生的乙酸等短链脂肪酸（SCFA）可以降低肠道pH值，促进益生菌的生长，减少幼龄动物腹泻率[25]。本研究发现，丁酸梭菌组肉牛粪便中大肠杆菌含量显著低于对照组，表明日粮中添加丁酸梭菌能够降低肉牛肠道中大肠杆菌数量。原因可能是丁酸梭菌产生的丁酸菌素具有抑制或杀灭大肠杆菌的作用。Hess等[26]在使用抗生素研究细菌侵袭试验时发现，细胞内外细菌总量的差异可以通过使用抗生素杀灭胞外细菌实现，胞内细菌总数会受到乳酸菌代谢所产生的抗菌物质的影响而降低，一部分乳酸菌可以通过其代谢活动影响大肠杆菌、李斯特菌等有害菌的增殖[27]。本试验中，丁酸梭菌组肉牛粪便中乳酸菌含量极显著高于对照组，表明日粮中添加丁酸梭菌能够有效促进在肉牛肠道中乳酸菌的增殖。乳酸菌代谢产生乳酸和过氧化氢等具有抑菌作用的物质，产生的乳酸可以降低动物肠道pH值，使肠道保持酸性环境，维持肠道环境稳态。本试验中，试验组肉牛粪便中沙门氏菌的数量低于对照组，试验组肉牛粪便梭菌的数量高于对照组，但差异不显著，可能与采样方法、样本量和粪便混合的均匀度有关。因此，添加丁酸梭菌可以减少大肠杆菌等有害菌的排出，为肉牛生产降低环境微生物带来的危害。3.4丁酸梭菌对肉牛血清生化指标的影响本试验中，丁酸梭菌组肉牛血清中的TP含量显著高于对照组，血清中TP含量主要反映肉牛生长过程中机体对于蛋白质代谢水平和营养摄入水平，指标升高可以体现机体对营养物质的高效吸收。郑爱娟等[28]研究发现，在肉鸡的日粮中添加丁酸梭菌可以显著提高42日龄肉鸡血清中TP含量。何家俊等[10]研究发现，在犊牛日粮中添加丁酸梭菌能够显著提高血清中TP含量，与本试验研究结果一致。谷丙转氨酶（ALT）是动物体内重要的氨基酸转移酶，能够促进蛋白质的合成[29]。血清中蛋白质合成过剩时，蛋白质会被分解成氨基酸，在酶的作用下脱氨基生成氨，部分随尿液排出体外，部分在反刍动物体内参与瘤胃尿素循环，在ALT活性相对较高的水平下，可以减少日粮被吸收蛋白质的浪费，提高饲料利用率。本试验中，丁酸梭菌组血清中ALT活性显著高于对照组，表明肉牛机体维持蛋白质的高效合成，降低体内氨的合成，促进机体健康，与何家俊等[10]在犊牛上的研究结果保持一致，但是生长期肉牛与犊牛不同，在血清中葡萄糖等指标有所差异。丁酸梭菌的研究在单胃动物上应用较多，因此，还需要更多的试验去探索丁酸梭菌对肉牛的血清生化指标的影响以及适宜的添加量。4结论在肉牛的基础日粮中添加20 g/(头·d)的丁酸梭菌，可以通过代谢产生的多种消化酶和氨基酸提高营养物质在瘤胃内的消化率，提高平均日增重；降低肠道中有害菌含量，提高乳酸菌的增殖，促进肉牛肠道健康；提高血清中TP含量和ALT活性，促进蛋白质的代谢合成，降低氨的合成，利于机体健康。因此，丁酸梭菌可以在生长期肉牛生产中应用。