鲟鱼肉脂肪少且富含不饱和脂肪酸，具有较高的营养和经济价值。杂交鲟具有生长速度快、抗病性强和适应能力强等优势，西伯利亚鲟×施氏鲟的杂交种（俗称西杂）是我国目前养殖的主要鲟鱼品种[1]。藤茶是指葡萄科蛇葡萄属的显齿蛇葡萄[2]，为药食两用藤本植物。藤茶中含有黄酮类、多糖类、酚类、氨基酸等多种营养成分，主要活性成分为黄酮类化合物。现代药理研究表明，藤茶及其有效成分具有降糖、降脂、抗氧化、抑菌和免疫调节等作用[3-4]。研究发现，日粮中添加总黄酮能够降低仔猪腹泻率和咳喘率，提高免疫功能和生长性能[5]。但水产动物上的应用较少。本试验以杂交鲟幼鱼为研究对象，分析饵料中添加藤茶总黄酮对杂交鲟幼鱼生长、消化、血清生化及血清免疫指标的影响，探究藤茶总黄酮的适宜添加量，为藤茶总黄酮在杂交鲟配合饵料中的应用提供参考。１材料与方法1.1试验设计杂交鲟（施氏鲟♂×西伯利亚鲟♀）幼鱼购自贵州省松桃吉光农业发展有限责任公司。试验水箱规格为120 cm × 40 cm × 40 cm，水深30 cm。挑选初重（32.73±1.33）g、180尾杂交鲟幼鱼进行试验，随机分为4组，每组3个重复（每个水箱即为1个重复），每个重复15尾鱼。试验期60 d。试验用水为曝气后的自来水。试验期间溶解氧为6.5~8.0 mg/L，氨氮小于0.05 mg/L，pH值7.5~8.0，水温18.1~21.7 ℃；每日换水1次，换水量为总养殖水体的1/3。藤茶总黄酮购自西安天丰生物科技股份有限公司。配制4种试验饵料。基础饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.013.T001表1基础饵料组成及营养水平项目F0组F1组F2组F3组原料组成鱼粉40.0040.0040.0040.00豆粕30.0030.0030.0030.00次粉18.0018.0018.0018.00鱼油7.007.007.007.00大豆磷脂2.002.002.002.00藤茶总黄酮0.000.250.501.00纤维素2.001.751.501.00沸石0.150.150.150.15预混料0.850.850.850.85合计100.00100.00100.00100.00营养水平粗蛋白41.2941.5341.4941.20粗脂肪11.7711.4911.7111.79注：1.预混料由胆碱0.2%、防霉剂0.02%、甜菜碱0.1%、复合维生素0.32%、复合微量元素0.23%组成。2.预混料为每千克饵料提供：VC 600 mg、VE 60 mg、VK 10 mg、VA 3 mg、VD3 3 mg、VB1 15 mg、VB2 15 mg、VB6 50 mg、VB12 20 mg、烟酸200 mg、叶酸10 mg、肌醇1 000 mg、生物素5 mg、泛酸钙50 mg、铁50 mg、铜3 mg、锰15 mg、碘0.6 mg、硒0.4 g、钴0.1 g。3.营养水平均为实测值。%基础饵料组（F0组）、0.25%藤茶总黄酮组（F1组）、0.50%藤茶总黄酮组（F2组）和1.00%藤茶总黄酮组（F3组）。各组原料粉碎过60目筛，逐级混匀，制成粒径为1.5 mm的颗粒饵料。每日投喂3次，投喂量为鱼体质量的2%~4%，根据鱼摄食情况和水温变化及时调整每日每餐的投喂量，以试验鱼饱食且无残饵为宜，每2 w称重鱼体1次，每日排污1次。1.2测定指标及方法1.2.1生长性能增重率(WGR)=(Wt－W0)/W0×100%(1)特定生长率(SGR)=(lnWt－lnW0)/t×100%(2)成活率(SR)=(Nt/N0)×100%(3)式中：Wt为鱼末重（ｇ）；W0为鱼初重（ｇ）；t为试验时间（d）；Nt试验结束鱼尾数；N0为试验开始鱼尾数。1.2.2血清和肠道样品的采集养殖试验结束，鱼禁食24 h，每个重复随机选取3尾鱼，采用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐进行麻醉，尾静脉采血，血样4 ℃静置1 h，3 500 r/min离心10 min，上层血清分装于离心管，用于测定血清的生化和免疫指标；取前肠样品，用于肠道形态的测定。1.2.3全鱼营养成分采用凯氏定氮法（GB/T 6432—1994）测定粗蛋白质，采用索氏抽提法（GB/T 6433—1994）测定粗脂肪，采用550 ℃灼烧法（GB/T 6438—1992）测定粗灰分，采用105 ℃烘箱干燥法（GB/T 6435—2006）测定水分含量。1.2.4肠道消化酶、血清生化指标和血清免疫指标取1.2.2中的血清样品，采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定肠道消化酶、血清生化指标和血清免疫指标，蛋白酶活力测定采用福林-酚试剂法，以标准L-酪氨酸浓度和吸光值做标准曲线，计算蛋白酶活力。蛋白酶活力单位定义：每分钟内分解出1 μg酪氨酸的酶量称为一个单位[6]。1.2.5肠道组织切片制备及观察多聚甲醛对前肠进行固定，依次经过冲洗、乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片，HE染色，中性胶封藏后制成肠道组织切片，将组织切片置于光学显微镜观察并拍照，每张切片随机选取3个视野；利用Image pro plus 6.0软件分析皱襞高度和肌层厚度。1.2.6肠道微生物多样性每组随机采集3尾鱼的整个肠道内容物，将内容物迅速转移至冷冻管中，液氮保存。提取样品总DNA，利用PCR技术扩增建立细菌16S rDNA文库。将质检合格的文库送北京百迈客生物科技有限公司利用Illumina HiSeq 2500进行测序。将最终的OTU丰度及代表序列进行多样性分析、物种分类注释和差异分析。1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS 25.0软件的单因素方差分析（ANOVA），Duncan's多重比较法进行差异显著性分析。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1藤茶总黄酮水平对杂交鲟生长性能的影响（见表2）由表2可知，与F0组相比，F1和F2组杂交鲟的末重、增重率、特定生长率和成活率差异均不显著（P0.05）；F3组的杂交鲟的末重、增重率和特定生长率均显著降低（P0.05）。各组杂交鲟的成活率均为100%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.013.T002表2藤茶总黄酮水平对杂交鲟生长性能的影响组别初重/g末重/g增重率/%特定生长率/(%/d)成活率/%F0组33.31±1.2583.80±4.31a151.61±8.54a1.54±0.06a100.00±0.00F1组32.83±1.0580.09±7.06a144.32±25.57a1.48±0.18a100.00±0.00F2组32.20±2.3977.61±4.63a141.28±9.21a1.47±0.06a100.00±0.00F3组32.56±0.5765.01±3.75b99.72±12.83b1.15±0.11b100.00±0.00注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2藤茶总黄酮水平对杂交鲟血清生化指标的影响（见表3）由表3可知，与F0组相比，F1组杂交鲟血清的谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性及白蛋白含量均显著升高（P0.05）；F2组杂交鲟血清的谷草转氨酶活性显著降低（P0.05），白蛋白含量显著升高（P0.05）；F3组杂交鲟血清的甘油三酯含量和谷丙转氨酶活性显著升高（P0.05），葡萄糖含量和谷草转氨酶活性显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.013.T003表3藤茶总黄酮水平对杂交鲟血清生化指标的影响组别谷草转氨酶/(U/L)谷丙转氨酶/(U/L)白蛋白/(g/L)葡萄糖/(mmol/L)总胆固醇/(mmol/L)甘油三酯/(mmol/L)F0组10.48±1.05b11.59±0.35c3.05±0.75c2.14±0.06a1.89±0.210.66±0.11bF1组23.48±2.97a14.70±1.65a7.40±0.48a2.54±0.13a2.39±0.570.70±0.04bF2组5.24±0.26c12.35±0.64bc5.84±0.90b2.47±0.39a1.94±0.190.72±0.10bF3组6.00±1.25c14.29±1.14ab3.77±0.12c1.54±0.30b1.73±0.020.98±0.07a2.3藤茶总黄酮水平对杂交鲟肠道消化酶的影响（见表4）由表4可知，与F0组相比，F1组杂交鲟的肠道蛋白酶和淀粉酶活性均显著升高（P0.05）；F2组杂交鲟的肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均显著升高（P0.05）；F3组杂交鲟的蛋白酶和淀粉酶活性均显著升高（P0.05），脂肪酶活性显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.013.T004表4藤茶总黄酮水平对杂交鲟肠道消化酶的影响组别蛋白酶/(U/g prot)淀粉酶/(U/mg prot)脂肪酶/(U/g prot)F0组95.17±8.89d3.51±0.53d154.90±14.01bF1组178.72±9.43b10.70±1.47b149.02±10.35bF2组214.11±11.44a13.52±1.02a283.44±20.16aF3组141.38±9.57c6.14±0.80c111.98±11.92c2.4藤茶总黄酮水平对杂交鲟肠道形态的影响（见表5）由表5可知，与F0组相比，F2和F3组杂交鲟的皱襞高度显著升高（P0.05）；F3组杂交鲟的肌层厚度显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.013.T005表5藤茶总黄酮水平对杂交鲟肠道形态的影响组别皱襞高度肌层厚度F0组733.67±37.73b175.22±12.91aF1组746.52±34.38b172.13±7.96aF2组877.82±100.88a190.55±12.04aF3组996.39±59.69a120.70±6.46bμm2.5藤茶总黄酮水平对杂交鲟肌肉组分含量的影响（见表6）由表6可知，与F0组相比，F1组杂交鲟的粗灰分水平显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.013.T006表6藤茶总黄酮水平对杂交鲟肌肉组分含量的影响组别水分粗蛋白粗脂肪粗灰分F0组76.28±0.8216.77±0.874.34±0.161.25±0.02aF1组76.34±0.9717.22±0.494.06±0.361.18±0.02bF2组76.21±0.6316.71±0.314.32±0.191.28±0.01aF3组76.48±0.5517.08±0.934.13±0.311.28±0.07a%2.6藤茶总黄酮水平对杂交鲟血清免疫指标的影响（见表7）由表7可知，与F0组相比，试验组杂交鲟血清的过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力均显著升高（P0.05）；F1和F2组血清的碱性磷酸酶活性显著升高（P0.05）；F3组血清的酸性磷酸酶活性显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.013.T007表7藤茶总黄酮水平对血清免疫指标的影响组别酸性磷酸酶/(金氏/100 mL)碱性磷酸酶/(金氏/100 mL)过氧化氢酶/(U/mL)谷胱甘肽过氧化物酶/(U/mL)溶菌酶/(mg/L)超氧化物歧化酶/(U/mL)总抗氧化能力/(mmol/L)F0组51.63±2.86a20.01±3.41b5.10±0.90c815.09±43.02c11.24±0.59230.82±17.61c4.36±0.125dF1组52.52±2.86a26.64±0.35a35.08±5.09b1118.38±63.36ab10.22±0.53456.37±28.24b7.10±0.34bF2组45.38±2.86a29.89±3.12a33.45±2.71b1071.10±2.62b11.86±1.46476.72±26.23b6.10±0.28cF3组32.52±2.86b25.53±4.65ab50.59±8.36a1156.55±10.68a10.26±0.26630.23±39.00a8.29±0.18a2.7藤茶总黄酮水平对杂交鲟肠道菌群的影响2.7.1肠道微生物样本16S rDNA测序数据统计（见表8、图1）由表8、图1可知，试验组和基础饵料组杂交鲟的肠道内容物总计获得813 336条序列，1 213个OTUs，4个组有重叠OTUs 646个，占该总数的53.26%。结果表明，不同水平的藤茶总黄酮对杂交鲟幼鱼肠道细菌群落具有一个核心的微生物菌群。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.013.T008表8肠道微生物样本16S rDNA测序数据统计组别OTU 聚类数目/个序列数目/条合计1 213813 336F0组995218 246F1组990217 824F2组960184 555F3组998192 71110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.013.F001图1肠道菌群OTU韦恩图2.7.2门分类水平上肠道菌群结构分析（见图2）由图2可知，图中的菌群在分类学上主要归属于9个门，分别是蓝细菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、软壁菌门（Tenericutes）、衣原体（Chlamydiae）、螺旋体门（Spirochaetes）、放线菌门（Acidobacteria）和梭杆菌门（Fusobacteria）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.013.F002图2门分类水平上肠道菌群结构分析此外，0.25%藤茶总黄酮组的优势菌门为蓝细菌门和厚壁菌门，0.50%藤茶总黄酮组的优势菌门为变形菌门和厚壁菌门，1.00%藤茶总黄酮组的优势菌门为蓝细菌门和衣原体，基础饵料组的优势菌门为蓝细菌门和软壁菌门。结果表明，不同水平的藤茶总黄酮对杂交鲟肠道优势菌群有一定的影响。3讨论藤茶总黄酮能够促进仔猪机体蛋白质代谢，增加仔猪的生长速度，提高仔猪平均日增重[7]。鱼类血清生化指标与鱼类的营养和健康状况相关[8]。血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性可以作为评价肝脏健康的指标，肝脏细胞损伤可引起其活性升高[1]。本试验表明，日粮中添加0.50%藤茶总黄酮组对杂交鲟的肝脏未造成损伤，1.00%藤茶总黄酮组有可能对杂交鲟肝脏造成损伤，造成肝脏损伤的机理有待于进一步探索。鱼类消化食物和吸收营养物质的主要场所是肠道，机体正常的生长代谢和饲料中营养物质的消化与肠道中消化酶活性相关[9]。研究表明，动物机体生长与消化酶活性呈正相关[10]。山楂叶总黄酮可促进肉鸡小肠中胰蛋白酶和脂肪酶的活性[11]。本试验表明，日粮中添加0.25%或0.50%藤茶总黄酮均增加肠道内消化酶的活性，促进肠道对营养物质的消化吸收。鱼类主要通过小肠吸收营养物质，肠道的皱襞和绒毛在营养物质吸收方面起重要作用，皱襞和绒毛对维持肠道功能以及肠道健康状况很重要。肠黏膜的肌层厚度能够反映肠道的收缩能力[10]。研究发现，添加桑叶黄酮能够促进凡纳滨对虾肠道绒毛的发育[12]。本试验中，0.50%和1.00%藤茶总黄酮组杂交鲟的皱襞高度显著升高；0.25%藤茶总黄酮组杂交鲟的皱襞高度和肌层厚度无明显变化；0.50%藤茶总黄酮组杂交鲟的肌层厚度无明显变化。藤茶总黄酮影响皱襞高度的具体机理有待于进一步探索。水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分是鱼肉的基本组成成分，各成分含量直接影响鱼肉的品质[13]。脂肪是鱼类营养成分中含量差异明显的部分[14]，脂肪含量可以衡量鱼体脂肪积累量；粗灰分含量可以评价鱼骨的软硬[15]。日粮中添加桑叶黄酮对吉富罗非鱼肌肉粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分含量无显著影响[16]。本试验表明，0.50%和1.00%藤茶总黄酮组杂交鲟的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和水分含量无明显变化。因此，日粮中添加0.50%和1.00%藤茶总黄酮对杂交鲟肌肉组分含量无影响。酸性磷酸酶是在酸性条件下催化磷酸单酯水解的酶，参与磷酸酯的代谢调节、信号传导以及能量转化等[17]。碱性磷酸酶是一种膜结合蛋白，维持体内适宜的钙磷比例[18]，可直接参与生物体磷酸基团的转移和代谢[19-20]。酸性磷酸酶和碱性磷酸酶是巨噬细胞溶酶体的标志酶，可参与动物机体的免疫活动[21]。超氧化物歧化酶和过氧化氢酶是存在生物体内非常重要的抗氧化防御性功能酶，能够保护机体免受氧化伤害[22]。本试验发现，0.50%藤茶总黄酮组可通过增加碱性磷酸酶活性、超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性提高杂交鲟的免疫功能。肠道微生物影响鱼体的消化与吸收，可促进氨基酸、酶和短链脂肪酸等物质的形成[23]。一般情况下，菌群多样性和丰富度越高，不同菌群之间构成的动态平衡是宿主正常新陈代谢的基础[24]。众多中草药对肠道菌群的平衡产生影响。因此，中药的起效原因可能与肠道菌群结构关系紧密。研究发现，黄酮类植物成分可以影响肠道菌群[25]。研究发现，飞机草总黄酮提取物能够提高肉鸡肠道有益菌属的丰度，改善肠道菌群结构[26]。本试验表明，饵料中添加不同水平的藤茶总黄酮对杂交鲟肠道菌群多样性和丰富度无显著影响，而对肠道优势菌群具有一定的影响。4结论研究表明，饵料中添加藤茶总黄酮对杂交鲟幼鱼的血清生化指标、肠道消化酶活性、血清免疫指标、肠道形态具有显著影响。综合杂交鲟幼鱼情况，当饵料中藤茶总黄酮添加量为0.50%时，杂交鲟幼鱼具有较好的血清生化指标和肠道形态，杂交鲟幼鱼的肠道消化酶活性和免疫力有效提升。因此，本试验条件下，杂交鲟幼鱼饵料中藤茶总黄酮最适添加量为0.50%。