野菊的干燥头状花序是清热解毒、泻火平肝的中药[1]，可以药食两用。目前，有关野菊花中活性成分[2]和药理作用的研究较多[3-4]。野菊花茎叶中含有多糖[5]、黄酮[6]、萜类、微量元素等活性成分[7]。野菊茎叶多糖的研究报道较多围绕提取工艺[8]、分离纯化[9]、含量、结构、活性等[10]。如利用微波、超声波提取野菊茎叶多糖[11]，大孔吸附树脂柱、凝胶色谱、膜技术等富集纯化多糖[12]，测试多糖的抗氧化、抗菌、抗病毒等活性[13]，利用多种方法探索野菊茎叶及多糖的新用途[14]。植物多糖的独特活性已经广泛在动物的养殖和生产中[15]应用，可作为饲料添加剂[16]。野菊花多糖在雏鸡免疫力调节上具有明显作用[17]。关于野菊茎叶提取物安全性的评价较少，参照植物多糖安全性试验[18]，试验对提取的野菊茎叶多糖，经致突变性检测（Ames）、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核、小鼠精子畸形等遗传毒性检测和30 d喂养试验，评价野菊茎叶多糖的毒性和安全性，为野菊茎叶多糖作为畜禽饲料添加剂以及在养殖业中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料野菊茎叶采自秦岭北麓，粉碎。鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102（中国食品药品检定研究院）、伊红和生化试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、动物肝细胞S-9液（无锡欣润生物科技有限公司）；10% S-9混合液现用现配。20只18~21 g KM小鼠(雌、雄各半)；20只186~219 g SD大鼠（雌、雄各半）；60只25~30 g KM小鼠（雌、雄各半）；30只28~33 g KM小鼠（全雄）；80只64~83 g SD大鼠（雌、雄各半）（四川SCXK(m)2010-01）。主要试剂：2-AF（2-氨基芴）（Aldrich公司）；β-萘黄酮、葡糖、CP（环磷酰胺）、Et2O、4-磷基喹啉-N-氧化物、1,8-二羟基蒽醌、NaN3、苯巴比妥、C6H5OH、D-葡糖-6-磷酸钠盐、H2SO4等试剂均为分析纯（西安化学试剂厂）；丝裂霉素C（MMC）（Sigma公司）。主要仪器：AU-400全自动生化分析仪、BH-2显微镜（olympus）；XT-2000I全自动血细胞分析仪（Sysmex公司）、TU-1900紫外可见分光光度计（济南笃尚科学仪器公司）、解剖器械及工作台（广州凯秀贸易有限公司）。1.2试验方法1.2.1野菊茎叶多糖提取及含量检测原料以Et2O脱色、95% EtOH脱除单糖，超声法提取多糖除蛋白、纯化[8-9]，称重，α-萘酚检验显色，茚三酮不显色。多次重复提取合并为测试物。采用C6H5OH-H2SO4法检测含量[11]，以不同浓度葡糖溶液为基准，加苯酚溶液和浓H2SO4水浴反应，冷却，490 nm处以水为空白测量吸光度。称量测试物1.00 mg，定容检测含量。1.2.2Ames试验推荐用量250 mg/60 kg BW。测试物以水调配1、5、25、125、625 µg/皿剂量组、水对照组、自发对照组和阳性对照。活化系统以苯巴比妥和β-萘黄酮合用诱导雄性大鼠肝S9，配成混合液，间接致突变物测定S9活性，高压蒸汽灭菌，在添加和不添加S9下试验[19]，重复3次。1.2.3骨髓细胞微核试验阴性对照组、40 mg/kg BW CP阳性对照组以及250、500、1 000 mg/kg BW剂量组。每日以20 mL/kg BW量经口灌胃，首例染毒观察30 h，采用30 h两次给药法将小鼠分成5组，每组6只。试验后处死小鼠，取胸骨髓制片，固定染色，每只小鼠计量1 000个嗜多染红细胞（PCE）中含微核PCE数（油镜下），确定微核细胞率[20]。1.2.4精子畸形试验所设阴性对照组、阳性对照组和剂量组同“1.2.3骨髓细胞微核试验”。经口灌胃20 mL/kg BW量，持续5 d，首例染毒，观察35 d，将雄性小鼠随机分成5组，每组6只，按量连续5 d灌胃。参考文献[20]方法操作核查精子畸形数目和类型，计算精子畸形率。1.2.530 d喂养试验剂量组为102、206、414 mg/kg BW相当于推荐量的25、50、100倍，对照组为市售饲料。拌饲法首例染毒观察30 d，将大鼠雌、雄对半分成4组，每组20只。按剂量调配含测试物饲料，钴-60消毒灭菌。连续30 d试验中大鼠自由饮水、进食，每日查看行为动作、状态表现、中毒或死亡现象，每周合计进食量2次、称量体重1次，确定食物利用率。试验后大鼠麻醉采血，检验血液生化和血液学指标；处死解剖查验内脏状态，称量肝、肾、脾、睾丸计算脏体比，胃肠、卵巢等作组织病理学检查。1.3数据统计与分析采用卡方检验统计细胞微核试验数据，精子畸形试验采取秩和检验，30 d喂养试验结果进行方差齐性检验。试验数据采用SPSS 11.0软件处理。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1葡糖工作曲线和野菊茎叶多糖的含量葡萄糖工作曲线以吸光度为纵坐标（Y）、浓度为横坐标（X）：Y=15.038 0X+0.065 2，R2=0.998 3，在0.03~0.09 g/L内与吸光度呈线性关系。野菊茎叶多糖占其茎叶干重（5.56±0.34）g/100 g，含量(98.23±0.25)%。2.2野菊茎叶多糖的Ames试验分析（见表1）由表1可知，TA97、TA98、TA100、TA102试验菌株添加和不添加S9的结果中，各剂量组的平均回变菌落数均未超过自发对照组或水对照组的2倍，阳性对照组均为自发对照组或水对照组的2倍以上，呈阳性反应，说明野菊茎叶多糖未诱导试验菌株回变菌落数增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T001表1野菊茎叶多糖的Ames试验分析组别TA97TA98TA100TA102-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S91 µg/皿组132.0±5.6136.3±10.433.0±4.034.7±3.5147.7±11.5143.7±12.6260.0±11.8265.3±18.55 µg/皿组126.3±11.2133.7±8.737.3±3.536.0±4.0138.0±13.1147.3±10.0254.0±13.2260.0±16.525 µg/皿组134.3±8.4132.7±13.335.7±5.535.2±1.5149.7±10.7138.0±4.4261.3±14.6271.7±7.5125 µg/皿组124.7±9.0133.7±11.038.0±5.636.0±6.2150.0±8.0145.0±8.2251.7±17.8263.7±17.2625 µg/皿组146.3±7.6131.3±7.035.3±7.538.0±6.0138.7±13.9147.7±7.4261.3±11.9253.7±18.6水对照组122.3±12.4125.0±9.536.0±4.036.3±4.5143.3±14.0142.7±12.2256.3±14.7262.3±8.5自发对照组128.0±13.7132.7±13.333.0±2.633.3±3.5142.3±10.0150.7±9.5263.0±11.0260.7±13.5阳性对照组923.0±67.5937.0±40.1369.3±50.91 239.3±99.21 252.0±127.01 295.7±110.21 436.0±127.3915.7±78.72.3野菊茎叶多糖对小鼠骨髓细胞微核分析（见表2）由表2可知，测试物的剂量组雌、雄鼠的微核细胞率与阴性对照组差异不显著（P0.05）。CP阳性对照组测试物剂量组PCE/NCE比值高于对照组，没有出现测试物诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核细胞率增高的现象。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T002表2野菊茎叶多糖对小鼠骨髓细胞微核分析项目组别检查PCE数/个含微核PCE数/个微核细胞率/‰PCE/NCE比值雄阴性对照组6 00071.40±0.881 000/9001.11±0.05250 mg/kg BW组6 00051.00±1.271 000/8771.14±0.04500 mg/kg BW组6 00081.60±0.741 000/8841.13±0.041 000 mg/kg BW组6 000112.20±0.901 000/8621.16±0.0540 mg/kg BW(CP)组6 00011422.80±3.21**1 000/8851.13±0.05雌阴性对照组6 00061.20±0.531 000/8921.12±0.05250 mg/kg BW组6 000102.00±0.851 000/8761.14±0.05500 mg/kg BW组6 00091.80±0.411 000/8931.12±0.041 000 mg/kg BW组6 000121.40±1.131 000/8681.15±0.0540 mg/kg BW(CP)组6 0009619.20±2.55**1 000/8841.13±0.04注：与阴性对照组相比，“**”表示差异极显著（P0.01）；下表同。2.4野菊茎叶多糖对小鼠精子畸形评价（见表3）由表3可知，野菊茎叶多糖的剂量组精子畸形率与阴性对照组相比差异不显著（P0.05），CP阳性对照组精子畸形率极显著高于阴性对照组（P0.01）。精子畸形类型的形态多为无钩和不定型，说明野菊茎叶多糖不能增加小鼠精子畸形率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T003表3野菊茎叶多糖对小鼠精子畸形评价组别受检精子数/条精子畸形类型精子畸形数/条精子畸形率/%无钩不定型香蕉头胖头双尾双头尾折叠阴性对照组6 00035331213010941.88±0.1325 mg/kg BW组6 0005133660009619.2±0.28500 mg/kg BW组6 00043358130009919.8±0.321 000mg/kg BW组6 0004441890001022.04±0.2940 mg/kg BW(CP)组6 0007020519231103196.38±0.42**2.5野菊茎叶多糖对大鼠30 d喂养试验的观察喂养期间大鼠体态良好，健康活泼，体重逐日增加，被毛有色泽光滑柔顺，大小便正常，大鼠每日食用不同剂量的野菊茎叶多糖后均未出现中毒病症，无死亡现象。2.5.1野菊茎叶多糖对大鼠体重的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，剂量组雌、雄大鼠的各时间点体重差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T004表4野菊茎叶多糖对大鼠体重的影响项目雄雌对照组102 mg/kgBW组206 mg/kgBW组414 mg/kgBW组对照组102 mg/kgBW组206 mg/kgBW组414 mg/kgBW组初重72.8±4.173.5±4.573.2±4.373.5±5.272.5±4.773.6±5.374.4±5.173.8±4.7第1 w126.3±7.9125.6±8.6127.4±9.0124.8±7.3125.8±6.5122.2±5.1126.3±6.8123.1±5.9第2 w187.9±8.5188.3±13.6191.7±13.2190.2±10.4157.4±12.3160.9±7.8163.9±5.2161.3±5.9第3 w242.1±8.6241.3±21.5246.8±17.4244.9±12.9191.7±9.8184.6±8.1189.2±8.3187.6±8.7第4 w296.9±11.5301.1±22.3306.2±19.8297.2±14.7213.8±12.9206.5±6.6212.8±9.1208.3±9.4第30 d312.4±12.5315.1±24.3320.1±18.8312.6±14.6218.2±14.9210.1±7.8216.9±8.1209.2±10.2禁食后277.1±12.5279.3±20.7283.8±16.9276.1±13.1198.3±13.4190.5±9.6197.4±7.8189.2±8.5g2.5.2野菊茎叶多糖对大鼠每周进食量的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，各剂量组雌、雄大鼠试验第1 w至第4 w每周的进食量差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T005表5野菊茎叶多糖对大鼠每周进食量的影响项目第1 w第2 w第3 w第4 w雄对照组105.9±7.2153.1±4.8165.4±5.8179.8±5.1102 mg/kg BW组105.1±6.8149.5±7.5169.8±6.2185.2±7.6206 mg/kg BW组106.3±4.7148.7±6.9166.5±7.9182.7±8.7414 mg/kg BW组103.8±6.3145.2±7.1164.9±6.3184.3±4.2雌对照组102.1±4.9126.1±5.5153.2±5.7167.1±5.9102 mg/kg BW组100.2±4.5125.5±5.6143.9±8.4161.6±9.5206 mg/kg BW组99.7±5.1123.2±6.8142.6±6.6157.2±7.1414 mg/kg BW组98.4±5.5122.4±8.2143.1±8.5159.1±5.4g2.5.3野菊茎叶多糖对大鼠食物利用率的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，剂量组雌、雄大鼠的每周食物利用率、总食物利用率以及低剂量组雌鼠第3 w食物利用率显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T006表6野菊茎叶多糖对大鼠食物利用率的影响项目雄雌对照组102 mg/kgBW组206 mg/kgBW组414 mg/kgBW组对照组102 mg/kgBW组206 mg/kgBW组414 mg/kgBW组总增重/g240.2±11.8242.5±22.3245.7±16.1239.6±13.4142.8±13.6138.9±8.2142.1±6.5132.7±11.9总进食量/g660.1±15.7671.3±21.2655.6±27.5653.2±13.4593.5±20.8579.7±31.3565.8±24.9567.4±23.6第1 w食物利用率/%50.12±4.1351.28±3.9252.75±5.1649.98±4.0750.46±3.8547.81±4.0350.02±4.2149.37±5.08第2 w食物利用率/%41.19±2.7840.86±3.3542.57±4.6943.62±3.5426.11±8.1731.08±3.1631.22±2.3531.18±3.02第3 w食物利用率/%32.33±4.0831.25±4.2334.16±3.7934.31±2.0822.85±4.5317.67±4.77*18.31±3.4418.12±3.51第4 w食物利用率/%31.12±4.0732.45±3.4631.87±4.7228.66±3.2913.09±2.5313.51±2.3814.98±2.3211.75±3.11总食物利用率/%35.13±3.2236.63±3.3538.19±3.1337.28±2.0624.21±2.5323.47±1.6825.22±1.5223.48±1.97注：“*”表示与对照组相比差异显著（P0.05）。2.5.4野菊茎叶多糖对大鼠血液学指标的影响（见表7）由表7可知，与对照组相比，剂量组雌、雄大鼠的红细胞、白细胞、中性粒细胞等血液学指标差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T007表7野菊茎叶多糖对大鼠血液学指标的影响项目雄雌对照组102 mg/kgBW组206 mg/kgBW组414 mg/kgBW组对照组102 mg/kgBW组206 mg/kgBW组414 mg/kgBW组红细胞/(×1012/L)8.75±0.238.96±0.478.84±0.758.51±0.698.62±0.678.25±1.138.18±0.618.59±1.04白细胞/(×1012/L)5.39±0.795.54±1.385.62±0.755.51±0.903.61±0.683.74±0.564.05±1.213.89±1.14中性粒细胞/%14.98±2.2517.36±7.8214.79±3.6614.18±3.9811.32±2.4511.66±4.2711.23±2.8312.43±11.5淋巴细胞/%75.06±4.7573.23±7.1674.52±5.0875.64±3.7382.26±4.4880.47±5.6281.25±7.1279.68±10.4单核细胞/%7.48±1.897.76±2.157.91±2.337.85±2.564.96±2.376.01±2.755.96±3.285.65±1.85嗜酸粒细胞/%2.61±3.651.59±0.881.47±0.521.32±0.852.15±1.172.20±1.322.31±2.091.99±0.84嗜碱粒细胞/%0.14±0.210.16±0.320.18±0.210.15±0.240.11±0.100.18±0.140.15±0.160.09±0.102.5.5野菊茎叶多糖对大鼠血液生化指标的影响（见表8）由表8可知，各项指标差异均不显著（P0.05），数值均在正常值范围内。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T008表8野菊茎叶多糖对大鼠血液生化指标的影响项目雄雌对照组102 mg/kgBW组206 mg/kgBW组414 mg/kgBW组对照组102 mg/kgBW组206 mg/kgBW组414 mg/kgBW组谷丙转氨酶/(U/L)28.65±6.2330.04±5.1828.93±4.2129.65±5.0321.03±4.1122.26±3.2323.05±2.1623.46±3.58谷草转氨酶/(U/L)89.85±16.4592.67±11.7288.63±12.2490.76±8.5380.56±10.6284.32±12.3983.14±7.7681.85±7.52尿素氮/(mmol/L)7.12±0.857.36±1.216.98±0.667.21±1.328.03±0.687.86±1.778.15±1.058.58±1.96肌酐/(µmol/L)34.98±2.8236.52±3.5735.12±1.8535.88±2.6437.86±3.3938.12±2.3338.75±3.5438.92±4.23胆固醇/(mmol/L)1.08±0.251.14±0.231.07±0.581.16±0.371.30±0.281.29±0.541.19±0.621.15±0.29血糖/(mmol/L)6.82±0.696.67±0.336.52±0.416.29±0.657.89±0.367.46±0.527.18±0.567.27±0.48总蛋白/(g/L)57.85±2.4557.36±3.8957.41±2.2358.12±3.4657.50±2.3157.18±1.9656.27±1.8456.76±2.40白蛋白/(g/L)31.92±2.0331.79±1.8632.15±1.4731.92±1.3331.81±1.2631.23±0.8530.85±1.1430.93±1.52甘油三酯/(mmol/L)0.38±0.070.39±0.110.42±0.120.41±0.130.30±0.050.33±0.090.28±0.110.29±0.082.5.6野菊茎叶多糖对大鼠脏体比的影响（见表9）由表9可知，剂量组雌、雄大鼠的肝体比、脾体比、肾体比以及雄鼠的睾丸体比与对照组组相比差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T009表9野菊茎叶多糖对大鼠脏体比的影响项目雄雌对照组102 mg/kgBW组206 mg/kgBW组414 mg/kgBW组对照组102 mg/kgBW组206 mg/kgBW组414 mg/kgBW组肝脏湿重/g9.69±1.089.75±1.129.71±1.019.63±0.986.73±1.026.21±0.656.61±0.556.41±0.83肝体比/%3.48±0.513.55±0.213.43±0.163.49±0.263.42±0.263.31±0.193.36±0.213.38±0.29脾脏湿重/g1.06±0.371.11±0.221.10±0.231.12±0.310.72±0.110.73±0.150.75±0.140.71±0.12脾体比/%0.38±0.060.40±0.080.38±0.090.41±0.070.39±0.050.37±0.080.36±0.070.38±0.06肾脏湿重/g2.61±0.212.52±0.342.62±0.252.55±0.231.78±0.121.76±0.081.78±0.161.74±0.15肾体比/%0.95±0.050.91±0.080.89±0.070.92±0.090.91±0.110.89±0.060.92±0.080.93±0.05睾丸湿重/g3.17±0.223.15±0.283.19±0.253.12±0.21————睾体比/%1.16±0.091.14±0.121.15±0.111.13±0.12————注：“—”表示无此项指标。2.5.7野菊茎叶多糖对大鼠的病理学检验（见表10）大体解剖查勘内脏和肉体，无异常变化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T011续表10　野菊茎叶多糖对大鼠的病理学检验大鼠内脏病变空白对照组(n=20)高剂量组(n=20)脾脏红髓扩张、纤维组织增生00脾小体菱缩、色素沉着00脾窦扩张、充血、炎细胞浸润00巨噬细胞增生、肉芽肿形成00淋巴组织增生、髓外造血00胃黏上皮变性、坏死、皮肠化00固有层炎细胞浸润00固有层腺体减少、腺体肥大增生00空肠黏膜上皮变性、坏死00黏膜下层充血水肿、肉芽肿形成00肠壁各层炎细胞浸润00睾丸生精细胞减少、变性、坏死00多核巨细胞00间质炎细胞浸润、间质水肿00卵巢卵巢萎缩，脓肿，囊肿00间质腺、间质细胞增生00由表10可知，对照组有1例大鼠肝脏汇管区轻度炎细胞浸润，其余受检组织都正常；高剂量组有1例大鼠肾脏局部肾小管扩张、1例大鼠肝脏汇管区轻度炎细胞浸润，其余受检组织均正常。野菊茎叶多糖高剂量组不会引起大鼠中毒性损伤改变。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.017.T010表10野菊茎叶多糖对大鼠的病理学检验大鼠内脏病变空白对照组(n=20)高剂量组(n=20)肝脏被膜改变、肝淤血，水肿00肝小叶散在点状坏死、散在小灶状坏死00肝小叶水样变性、嗜酸性变00纤维组织增生、小胆管增生00肝小叶轻度脂肪变性00肝汇管区炎症细胞浸润11髓外造血00肾脏被膜改变00肾小球细胞增生、变性、炎细胞浸润00肾小管变性、坏死、肾小管内管型00肾小球玻璃样变性、硬化00肾间质易灶炎细胞浸润、纤维增生00局灶肾小管、集合管扩张00局灶肾小管细胞变性、集合管细胞变性01肾盏黏膜变性、黏膜下组织炎细胞浸润、纤维增生00单纯性囊肿/局灶性肾小管矿物质沉着003讨论遗传毒性试验结果表明，野菊茎叶多糖对小鼠无致突变作用，与多糖的结构、活性存在联系[10-11]。本试验中，试验期间大鼠没有表现中毒及死亡情况，与对照组相比，第3 w雌鼠低剂量组的食物利用率明显降低；高剂量组的野菊茎叶多糖没有引起大鼠中毒性损伤改变。表明野菊茎叶多糖能够作为饲料添加剂使用。4结论野菊茎叶多糖对动物无毒、无致突变以及无中毒性改变，能够为野菊茎叶多糖在饲料添加剂的开发、应用、深加工以及野菊茎叶的资源化综合利用等方面提供参考。