金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl）是兰科多年生草本植物[1]。金钗石斛中含有石斛多糖、石斛碱以及氨基酸等功能性成分[2-3]，具有清除自由基、保护胃黏膜、提高免疫力等功能[4]，在药品、保健品、功能性食品的生产中广泛应用的同时也产生了大量的石斛渣。目前，对金钗石斛残渣除燃烧、填埋外仍没有较好的处理途径，既污染环境，又造成了大量的资源浪费[5-6]。废弃的石斛渣中仍含有大量石斛多糖等功能性成分。研究表明，多种植物多糖具有明显的抗氧化及抑菌作用，饲料中添加中草药多糖后，动物的胃肠功能、免疫功能均有明显改善，生产性能及肉品质明显提高[7-14]。研究表明，石斛渣经米曲霉、红曲霉发酵后多糖含量明显提高[15-17]。张周英等[18]、李蕾等[19]研究发现，石斛多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有较好的抑菌作用。饲料中加入发酵后的石斛渣，可以起防腐作用，改善饲料营养结构，提高动物的免疫力和肠道功能。本研究通过固态发酵技术提高金钗石斛渣中多糖含量，进而提高石斛渣的抑菌性，为中药渣制备功能性饲料添加剂的研究提供参考。1材料与方法1.1材料与设备1.1.1试验材料金钗石斛饮片购自成都康吉希大药房；葡萄糖标准品；苯酚、浓硫酸、苯甲酸均为分析纯；豆粕为市售。1.1.2培养基斜面活化培养基：PDA培养基。种子培养基[20]：4%葡萄糖、0.15%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁、0.7%硝酸钠、其余为水，pH值自然，121 ℃湿热灭菌20 min。固态发酵培养基：金钗石斛饮片100 g，加入300 mL水浸泡2 h，过滤，将浸泡后的石斛饮片放入破壁机中破碎，121 ℃湿热灭菌20 min，得金钗石斛渣，用于固态发酵。1.1.3仪器设备BSA124S分析天平购自北京海天友诚科技有限公司；DK-98-ⅡA恒温水浴锅购自天津市泰斯特仪器有限公司；GNP-9080恒温培养箱购自江苏新春兰科学仪器有限公司；UV-2800型紫外可见光分光光度计购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BKQ-B50II高压蒸汽灭菌锅购自博科医疗器械有限公司；MJ-BL1503B破壁机购自广东美的集团股份有限公司。1.2试验方法1.2.1菌种活化及菌悬液制备参考文献[21-22]将红曲霉接种于PDA斜面培养基上，30 ℃培养3 d，向斜面培养基中加入一定量的无菌水，制成孢子悬液，将孢子悬液按2%接种量接种于种子培养基中，30 ℃ 180 r/min摇床培养3 d，制成浓度为2×106个/mL的红曲霉种子液。1.2.2红曲霉发酵金钗石斛渣单因素试验参考文献[23-24]方法并进行优化，以发酵体系中多糖含量作为评价指标，在红曲霉种子液添加量15%、发酵温度30 ℃、发酵时间9 d、初始pH值6的基础上进行分别考察种子液添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、发酵时间（3、6、9、12、15 d）、发酵温度（20、25、30、35、40 ℃）、初始pH值（4、5、6、7、8）对体系中多糖含量的影响，进行正交试验。1.2.3红曲霉发酵金钗石斛渣正交试验在单因素试验的基础上，设计L9(34)正交试验，确定红曲霉发酵金钗石斛渣的最优工艺条件，红曲霉发酵金钗石斛渣正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.020.T001表1红曲霉发酵金钗石斛渣正交试验因素水平A种子液添加量/%B发酵温度/℃C发酵时间/dD初始pH值115259522030126325351571.3测定指标及方法1.3.1饲料中的多糖采用乙醇沉淀法提取体系中的粗多糖，参照《中华人民共和国药典》2020版[25]苯酚-硫酸法进行测定。1.3.2饲料中的细菌总数参照GB/T 13093—2006《饲料中细菌总数的测定》[26]中的检测方法进行测定。2结果与分析2.1红曲霉发酵金钗石斛渣单因素试验结果2.1.1种子液添加量对多糖含量的影响（见图1）由图1可知，随红曲霉种子液添加量增加，多糖含量逐渐提高，种子液添加20%多糖含量达最高，随后多糖含量略有减少。主要因为红曲霉发酵可产生大量胞外多糖，红曲霉添加量过多，糖消耗量较大，体系中多糖被水解维持红曲霉生长代谢。因此，选择种子液添加量为15%、20%、25%设计正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.020.F001图1种子液添加量对多糖含量的影响2.1.2发酵温度对多糖含量的影响（见图2）由图2可知，温度对体系多糖含量的影响呈现先增后减的趋势。温度为30 ℃时，多糖含量最高达9.47%；温度超过30 ℃后，多糖含量显著下降。红曲霉生长的最适温度与代谢活性关系密切。因此，选择25、30、35 ℃设计正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.020.F002图2发酵温度对多糖含量的影响2.1.3发酵时间对多糖含量的影响（见图3）红曲霉生长存在延滞期[23-26]，因此，从发酵第3 d开始考察时间与多糖含量的关系。由图3可知，多糖含量基本与发酵时间呈正相关。发酵时间达12 d时，多糖含量增加趋势明显减缓。因此，综合发酵时间与多糖含量的关系及实际生产效率因素，选择发酵时间9、12、15 d设计正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.020.F003图3发酵时间对多糖含量的影响2.1.4初始pH值对多糖含量的影响（见图4）由图4可知，多糖含量与初始pH值的关系呈现先增后减的趋势。红曲霉发酵产多糖的最适pH值范围为5~6[27-28]，试验结果与理论值相近。由于不同基质不同环境条件微生物最适pH值不同。因此，选择pH值为5、6、7设计正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.020.F004图4初始pH值对多糖含量的影响2.2红曲霉发酵金钗石斛渣正交试验结果（见表2、表3）根据单因素试验结果，进行L9(34)正交试验，确定红曲霉发酵金钗石斛渣的最优工艺条件。由表2、表3可知，各因素对多糖含量的影响顺序为：初始pH值发酵温度种子液添加量发酵时间，最优酿造工艺参数为A2B2C2D1，即种子液添加量20%、发酵温度30 ℃、发酵时间12 d、初始pH值5。在此条件下进行试验验证，多糖含量达11.74%，为最优。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.020.T002表2红曲霉发酵金钗石斛渣正交试验结果项目ABCD多糖含量/%Y1Y2Y3y111119.8210.5610.5510.31212229.3610.0310.169.85313337.037.267.107.13421238.238.458.048.245223111.2511.6211.6911.52623129.489.629.499.53731329.179.389.239.26832138.038.058.258.11933219.8610.209.859.97k19.0979.2709.31710.600k29.7639.8279.3539.547k39.1138.8779.3037.827R0.6660.9500.0502.773因素主次DBAC最优方案A2B2C2D110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.020.T003表3红曲霉发酵金钗石斛渣正交试验方差分析项目Ⅲ类平方和自由度均方F值P值A2.60221.30121.3410.000B4.10122.05133.6410.000C0.01220.0060.0990.906D35.278217.639289.3740.000误差1.097180.061校正的总计43.09026注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.3金钗石斛渣对饲料抑菌性影响试验彭密军等[29]、肖和良[30]研究表明，饲料中添加20%~40%不同种类的中药材，可以起较好的抑菌效果，提高饲喂动物的免疫力。董延江等[31]、郭振等[32]研究发现，天然中草药经发酵后抑菌效果明显提高。金钗石斛渣经红曲霉发酵后，多糖含量明显增加，抑菌性也明显提高[17]。因此，将上述工艺发酵的金钗石斛渣灭菌后按比例添加入豆粕中，与常用防腐剂苯甲酸（添加量不超过1%）的抑菌效果进行对比，考察石斛渣对饲料抑菌性的影响。豆粕按液料比0.5 mL/g混合为湿豆粕后，以100 g为质量基准，分别配制发酵石斛渣、石斛渣豆粕、苯甲酸豆粕、纯豆粕4种饲料（平行3份），抑菌试验饲料配比见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.020.T004表4抑菌试验饲料配比成分发酵石斛渣石斛渣豆粕苯甲酸豆粕纯豆粕石斛渣1003000湿豆粕07099100苯甲酸0010g将以上各种饲料在25 ℃下储存3 d，测定各饲料的细菌总数，比较金钗石斛渣与苯甲酸的抑菌效果，不同饲料中细菌总数见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.06.020.T005表5不同饲料中细菌总数项目发酵石斛渣石斛渣豆粕苯甲酸豆粕纯豆粕细菌总数10 753225 867193 2331 631 977注：细菌总数为3个平行样本计算平均值后结果。CFU/g由表5可知，储存3 d未添加抑菌成分的纯豆粕细菌总数达1.6×107，远超国标对饲料细菌总数的要求（≦2×106），说明纯豆粕较易滋生细菌。组分单一的发酵石斛渣抑菌效果最好，细菌总数约为1.0×104，添加苯甲酸的豆粕储存3 d后细菌总数约为1.9×105，发酵石斛渣与豆粕3∶7混合，储存3 d细菌总数约为2.2×105，能够明显抑制细菌繁殖，且可达到国标要求，但抑菌效果较苯甲酸稍差。3讨论金钗石斛具有抗菌、提高免疫力等作用，但石斛渣并未被充分利用。研究表明，在动物饲料中添加中药渣可以提高饲喂动物免疫力，有效改善饲喂动物的肠胃功能、生长性能和肉质品质[33-35]。饲料中添加发酵石斛渣不仅可以合理利用资源，避免浪费，也是功能饲料研发生产的一个研究方向，但石斛渣中纤维素含量较多，蛋白质含量较少，如何既保证饲料营养均衡，又充分发挥其营养和抑菌效果以及石斛渣添加比例、与其他种类防腐剂复配的抑菌效果等尚需进一步深入研究。4结论种子液添加量20%、发酵温度30 ℃、发酵时间12 d、初始pH值5条件下发酵石斛渣，多糖含量达11.74%，此发酵石斛渣具有一定的抑菌作用，按一定比例添加入饲料中可达到国标对饲料中细菌总数的要求标准。