禁抗令的实施，部分促生长的药物添加剂暂停使用，富有生物活性的植物提取物成为抗生素替代品之一[1-3]。黄花菜具有药用价值、食疗价值、经济价值，但目前关于黄花菜饲用方面的研究较少。黄花菜中化合物主要有黄酮类、蒽醌类、甾醇类、萜类、二氢呋喃-γ-内酰胺类、酚酸类等，主要活性表现为抗抑郁、抗菌、抗癌、杀虫等[4-6]。陆福军[7]计算出黄花菜提取物的DPPH·清除率、亚硝酸盐清除率和亚硝胺抑制率分别为79.6%、66.9%和54.7%。潘炘[8]研究表明，水和乙醇浸提热风干燥和冷冻干燥黄花菜均显示出很好的总抗氧化能力、还原能力、金属螯合能力、去除超氧阴离子能力、DPPH·清除能力。周纪东等[9]证明，黄花菜粗多糖（CPH）的提取物对细菌具有特异性的抑制作用，菌落数为1×105~2×105时，溶液质量浓度大于25 g/L。本试验采用FRAP法、DPPH法评价黄花菜的花和根不同萃取部位的抗氧化活性；采用美国临床试验室标准化委员会（CLSI）推荐的微量稀释法评价黄花菜的花和根不同萃取部位的抑菌活性[10]，通过超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱分析化学成分。梅宁安等[11]利用黄花菜茎叶开发青贮饲料，得出25%、50%、100%黄花菜茎叶的添加量均可制作青贮，添加50%与玉米混合青贮效果较好，为合理利用黄花菜的茎叶提供依据。本试验旨在为黄花菜提取物作为抗氧化剂及抑菌剂的开发利用提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器黄花菜鲜品采自湖南长沙湖南农业大学金山基地（28°10'46.12" N，113°04'25.5" E）；经湖南农业大学卿志星博士鉴定为黄花菜（猛子花品种）。2,2-L联苯基-1-苦基肼基（DPPH）（上海麦克林生化科技有限公司）、FRAP总抗氧化能力检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；没食子酸丙酯、抗坏血酸、盐酸金霉素、胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）。所用菌种均购自中国典型培养物保藏中心。Agilent 1290超高效液相色谱仪-6530四极杆飞行时间质谱仪（美国安捷伦科技公司）。1.2试验方法1.2.1各萃取物的制备黄花菜新鲜的花和根样品清洗，切碎，分批装入圆底烧瓶，95%的乙醇作为溶剂，进行热回流提取，提取3次，每次2 h，过滤得乙醇浸提液，60 ℃减压浓缩至浸膏状，加入超纯水充分溶解，依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇充分萃取，合并有机层，将每萃取部位60 ℃减压浓缩至浸膏状，经冷冻干燥成粉。根和花各萃取所得样品分别标注为：G1、H1（石油醚萃取部位），G2、H2（二氯甲烷萃取部位），G3、H3（乙酸乙酯萃取部位），G4、H4（水饱和正丁醇萃取部位）。1.2.2抑菌活性评价试验1.2.2.1液体培养基的配制精确称取酵母粉1 g、胰蛋白胨2 g、氯化钠2 g，置于200 mL锥形瓶，加入超纯水200 mL，封口膜密封。高压蒸汽灭菌锅121 ℃灭菌30 min，冷却，4 ℃冰箱保存。1.2.2.2固体培养基的配制精密称取酵母粉4 g、胰蛋白胨8 g、氯化钠8 g。置于1 000 mL锥形瓶，加入超纯水800 mL，封口膜密封。高压蒸汽灭菌锅121 ℃灭菌30 min，冷却至50 ℃，分装于培养皿。1.2.2.3黄花菜提取物待测液的配制称取黄花菜提取物800 mg，二甲基亚砜（DMSO）作为助溶剂充分溶解样品，超纯水定容至10 mL棕色容量瓶，配制成80 g/L的溶液，0.22 µm滤膜过滤除菌，转移至10 mL离心管，4 ℃冰箱冷藏。1.2.2.4菌株的复苏、保存与菌悬液的制备在超净工作台里取出4种菌种，接种于装有适量LB液体培养基的离心管，恒温振荡器中37 ℃培养24 h。分别接种至2种不同固体培养基上纯化，菌株至少传3代，于培养基中培养16~18 h。1.3UPLC-Q-TOF-MS法鉴定化学成分1.3.1样品前处理称取样品约0.25 g置于玻璃锥形瓶，加入25 mL甲醇充分溶解，超声处理30 min取适量提取液于10 mL离心管，12 000 r/min离心10 min，取上清液，使用0.22 µm滤膜于液相色谱小瓶中。1.3.2色谱条件色谱柱：XAqua C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5 µm），流动相A为0.1%甲酸水（A），流动相B为0.1%乙腈（B），梯度洗脱，梯度如下：0~30 min，95%~55% A；30~40 min，55%~10% A；40~45 min，10%~10% A，柱温35 ℃，进样量5.0 μL，流速0.3 mL/min。1.3.3质谱条件扫描模式采用负离子全扫描模式（ESI-），脱溶剂温度为350 ℃，流速11 L/min，毛细管电压3 500 V，二级裂解电压：20~45 eV。1.4测定指标及方法1.4.1FRAP总抗氧化能力通过2倍稀释法准确配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的样品溶液，离心取上清液。标准曲线的配制：将0.027 8 g的FeSO4·7H2O使用超纯水定容至10 mL的定容瓶中配置成10 mmol的母液，使用超纯水将其10 mmo/L依次稀释成浓度为0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol。具体操作及总抗氧化能力的计算方法参照FRAP总抗氧化能力检测试剂盒说明书及文献[12]的方法进行，对照组为水溶性维生素E（Trolox）。1.4.2DPPH总抗氧化能力具体操作步骤参照文献[12]。测定采用VC和PG作为阳性对照，进行同样测试。1.4.3黄花菜溶液对4种细菌的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）采用美国临床试验室标准化委员会（CLSI）推荐的微量稀释法[10]进行。使用LB液体培养基将黄花菜待测液用2倍稀释法[13-14]稀释为10个梯度，分别为80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500、1.250、0.625 g/L，具体操作步骤参考文献[10]和[15]的方法。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2010软件进行整理，SPSS 25软件进行统计分析，Duncan's法进行多重比较。2结果与分析2.1各萃取部位及阳性对照的总抗氧化能力（见图1）由图1可知，FRAP法得出，G1~H4各萃取部位总抗氧化能力分别为1.36、1.41、3.01、0.99、0.44、0.68、6.88、1.51 mmol/g；Trolox组（对照组）总抗氧化能力为6.59 mmol/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.016.F001图1各萃取部位及阳性对照的总抗氧化能力H3黄花菜花部位的总抗氧化能力强于Trolox，其余均未表现明显的总抗氧化能力。2.2各萃取部位及阳性对照的DPPH·清除率（见图2）由图2可知，DPPH法，样品溶液浓度为0.4~1.0 g/L时，G3与H3样品的DPPH·的清除能力明显强于PG，与VC无明显差异，清除率均大于90.8%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.016.F002图2各萃取部位及阳性对照的DPPH·清除率2.3抑菌活性评价2.3.1抑菌效果筛选（见表1）由表1可知，G3、G4、H2、H4萃取部位基本无明显的抑菌效果，其余部位均表现一定的抑菌效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.016.T001表1抑菌效果筛选萃取部位大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌肠炎沙门氏菌G1++++G2++++++++G3－－+－G4－－－－H1+++－H2－－+－H3+++++++H4－－－－注：“－”表示无明显抑菌圈；“+”表示抑菌圈直径7.1~8.0 mm；“++”表示抑菌圈直径8.0~9.0 mm。2.3.2不同菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）值（见图3、图4）由图3可知，G1部位对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌的MIC值分别为5.0、2.5、10.0、5.0 g/L；G2部位分别为2.5、2.5、5.0、5.0 g/L；H1部位分别为10、20、20、10 g/L；H3部位分别为5.0、5.0、10.0、10.0 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.016.F003图3各部位样品的MIC结果显示，G2部位即根二氯甲烷萃取部位表现出了相对较强的抑菌效果。由图4可知，而上述四个部位的MBC值均≥10 g/L，杀菌效果并不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.016.F004图4各部位样品的MBC2.4不同样品的LC-MS结果分析（见表2）由表2可知，UPLC-Q-TOF-MS对具有明显活性的G1、G2、G3、H1、H3样品进行化学成分分析，各样品中化学成分具有明显差异，可能由各样品的抗氧化抑菌活性存在差异所致。通过MS以及MS/MS数据结合质谱裂解规律对各萃取部位所含化合物进行分析，上述5个部位初步鉴定出39个化学成分，主要为酚酸类、黄酮类及蒽醌类化合物。抗氧化活性较强的是G3、H3部位，主要为黄酮类化合物，具有较强的抗氧化活性，可能是黄花菜的根和花乙酸乙酯萃取部位具有抗氧化活性的物质基础；G1、G2、H1、H3部位表现一定的抑菌活性，初步推测此4个部位的主要化学成分为酚酸类和蒽醌类化合物，两类化合物可能是具有抑菌活性的物质基础。大黄酚大黄酸已经被证明具有一定的抑菌作用[16]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.016.T002表2不同样品的LC-MS结果分析编号保留时间/minm/z[M-H]-MS/MS离子碎片信息推测化合物分子式来源12.684405.146 3315.115 8、243.096 7、225.085 7Kwansonine CC16H26N2O10H3212.234179.034 5135.046 4、117.034 5、107.048 7咖啡酸C9H8O4H3313.116337.087 2191.051 9、173.046 4、163.036 8脱羟基-绿原酸Ⅰ/脱羟基-绿原酸Ⅱ/脱羟基-绿原酸Ⅲ/脱羟基-绿原酸ⅣC16H18O8G2、G3、H3414.831755.192 2591.126 5、301.022 9、300.016 2、271.012 5、178.985 2、150.991 4槲皮素-O-鼠李糖苷-O'-芸香糖C33H40O20G3515.523609.136 9301.032 9、300.025 8、271.021 3、178.997 4芦丁C27H30O16G3615.863389.103 6343.103 5、181.047 8、166.025 3乙氧基苯甲酸-O-葡萄糖苷C15H20O9G3、H3716.800463.081 9317.027 3、316.023 7、287.015 2、271.024 5、178.996 9、151.001 9杨梅素-O'-鼠李糖苷/杨梅酮-O-鼠李糖苷/金丝桃苷C21H20O12G3、H3816.962389.117 5343.102 7、181.047 5、166.028 7乙氧基苯甲酸-O-葡萄糖苷C15H20O9G2、H3918.899161.060 3143.048 9、117.032 2对甲基肉桂酸C10H10O2G2、H31019.401317.063 8273.042 7、165.014 3、153.017 5杨梅黄素C15H10O8G3、H31120.009577.149 2253.051 5大黄酚-O-麦芽糖C27H30O14H11220.215507.237 2344.055 6、316.052 5、301.037 7甲氧基-异鼠李素-O-葡萄糖苷C23H24O13H1、H31320.418623.150 6315.048 5、314.044 5、151.002 4异鼠李素-芸香糖苷C28H32O16G31420.631477.225 8314.043 6、299.017 1、285.037 6异鼠李素-3-O-葡萄糖苷C22H22O12H1、H31521.841353.098 5191.054 9、179.035 5、135.046 7隐绿原酸、新绿原酸、绿原酸C16H18O9G2、G3、H1、H31622.146343.078 5328.054 5、313.040 8乙醚-黄花蒽醌/甲氧基-乙醚-大黄素C18H16O7G1、G2、H11722.962299.052 8137.021 7苯甲酸-3-O-葡萄糖苷C13H16O8G2、H31824.658449.268 3316.022 4、287.019 9、271.023 8，178.997 4、151.003 4杨梅素-O-阿拉伯糖C20H18O12H31925.094299.053 0284.033 6、256.042 8、228.033 5黄花蒽醌、甲氧基-大黄素C16H12O6G1、G2、H32025.102741.222 8597.155 2、465.107 8、303.051 9槲皮素-O-芸香糖苷-O'-阿拉伯糖C32H38O20G3、H32126.284315.048 9302.045 4、153.016 7异鼠李素C16H12O7G3、H32229.019329.063 5314.045 5、299.018 4、285.041 7、271.025 7、243.032 5甲氧基-黄花蒽醌、二甲氧基-大黄素C17H14O7G2、G3、H12329.376563.247 4285.037 7、284.033 7、255.032 5、227.036 3、151.006 7山奈酚-O-鼠李糖苷-O'-阿拉伯糖C26H28O14G3、H32431.938461.117 5317.068 3异鼠李素-O-鼠李糖苷C22H22O11G2、G32532.240299.016 4284.023 8、255.025 5、227.034 5羟基-大黄酸C15H8O7G1、G2、H32633.783325.184 7193.047 7、149.052 5、134.035 4甲氧基-肉桂酸-O-阿拉伯糖C15H18O8G1、H32733.919313.238 5298.047 7、283.026 7、255.028 1甲基-黄花蒽醌C17H14O6G2、G32834.224253.048 1225.053 4、210.031 3、195.045 4大黄酚C15H10O4G1、G2、H32934.377445.129 6427.105 5、215.056 7羟基-萱草素C26H22O7G1、G23035.520593.064 4300.028 8、271.022 9、255.028 1、178.995 3、151.004 5槲皮素-O-鼠李糖苷-O'-鼠李糖苷C27H30O15G2、H1、H33138.850269.210 7240.043 5、239.032 2、211.043 72 -羟基大黄酚/大黄素C15H10O5G1、H33240.071367.238 4193.047 5、191.054 9、173.043 4甲基绿原酸C17H20O9G1、G2、H13340.170931.422 9769.222 9、314.042 5异鼠李素-O-芸香糖苷-O′-芸香糖苷C40H52O25G2、H13441.152505.227 7463.102 9、01.033 5、300.024 7、271.017 2、178.994 9、150.993 9乙酰基-金丝桃苷C23H22O13G3、H33541.457429.199 9414.114 5、399.083 9、386.113 4、371.093 7、328.071 3、215.072 5异萱草素Ⅰ/异萱草素Ⅱ/萱草根素C26H22O6G3、H13642.496355.160 3223.059 6、179.064 1、164.044 9、149.043 23，5-二甲氧基-肉桂酸-O-阿拉伯糖C16H20O9G23742.500695.466 3651.155 9、609.146 3、300.024 9羧基-乙酰基-芸香苷C30H32O19G2、G3、H13843.902771.394 3609.145 8、462.077 3、301.034 5芦丁-O-葡萄糖苷/杨梅素-鼠李糖苷-O'-芸香糖C33H40O21G33944.402327.290 6269.048 1、253.048 6、241.053 5甲氧基-6-甲基-黄花蒽醌C18H16O6G1、H13讨论本试验在黄花菜提取物粗分的基础上进行了进一步细分，采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇分别萃取，进行抗氧化抑菌的活性筛选以及各萃取部位化学成分的分析。研究表明，黄花菜中黄酮类化合物对超氧自由基、羟基自由基具有清除作用，黄花菜具有较好的抗氧化作用[16-19]，试验所采用的FRAP和DPP法与王智勇等[15]和赵玉静等[12]研究结果保持一致。抗氧化活性显著的根和花乙酸乙酯萃取部位初步推测含有多种黄酮类化合物，如芦丁、杨梅素、异鼠李素等，与之前研究结果相符。本试验所采用的微量稀释法与王智勇等[15]和何涛[20]的研究一致，样品溶解过程中均采用DMSO作为助溶剂。具有一定抑菌活性的G1、G2、H1、H3样品中初步推测出多种酚酸类及蒽醌类化合物，多个绿原酸类物质。绿原酸类物质也已证实对大肠杆菌、藤黄八叠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎杆菌等致病菌抑菌效果显著，且近年来绿原酸类物质在畜禽生产中应用较多[21]。虞夏晖等[22]通过提取大黄中的游离蒽醌，测定发现游离蒽醌对大肠杆菌、金黄色葡萄糖球菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌均有抑制作用，对双歧杆菌的生长抑菌作用最明显。通过UPLC-Q-TOF-MS结合质谱裂解规律分析具有抗氧化抑菌活性部位的化学成分，即根石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取部位和花石油醚、乙酸乙酯萃取部位，上述5个部位结合二级质谱数据初步鉴定出39个化学成分，主要是酚酸类、黄酮类及蒽醌类化合物。结果表明，黄花菜的根和花活性成分的极性偏小，高极性部位含量较少，采用乙酸乙酯和二氯甲烷可以对其有效萃取富集。Robert等[23]验证从黄花菜根中分离的11种物质对不同阶段的血吸虫（幼虫、成虫）存在抗性，认为2-羟基大黄酚和Kwanzoquinone E可开发成治疗血吸虫病的有效药物，黄花菜中粗多糖可以开发成天然抑菌剂[9]。本试验结果表明，黄花菜的根和花乙酸乙酯萃取部位具有一定的抗氧化性。根和花石油醚萃取部位、花乙酸乙酯萃取部位可作为抑菌剂添加到饲料中，为萱草属植物作为饲料添加剂的进一步开发提供新思路。周纪东等[9]、梅宁安等[24]和赵正伟等[25]研究表明，黄花菜茎叶可应用在畜牧养殖行业中，为黄花菜在饲料添加剂上的应用拓展新思考。4结论本研究采用FRAP法、DPPH法评价黄花菜的花和根不同萃取部位的抗氧化活性，根乙酸乙酯萃取部位（6.88 mmol/g）总抗氧化能力强于Trolox（6.59 mmol/g），其余萃取部位均未表现明显的FRAP总抗氧化能力。DPPH结果显示样品溶液浓度为0.4~1.0g/L时，黄花菜的根和花乙酸乙酯萃取部位的DPPH·的清除能力明显强于PG，与VC无差异，清除率均大于90.8%。初步筛选发现，根石油醚和二氯甲烷萃取部位、花石油醚和乙酸乙酯萃取部位表现一定抑菌活性，但杀菌效果不明显。以上部位UPLC-Q-TOF-MS结合质谱裂解规律分析，初步鉴定出39个化学成分。本试验结果为黄花菜作为抗氧化、抑菌等药理活性物质提供参考，为黄花菜提取物作为饲用抗氧化剂、抑菌剂的应用提供参考，也为饲料行业发展带来新思考。