随着食用菌总产量逐年上涨，废弃的菌糠量逐年增加[1-3]。研究发现，菌糠中含有丰富的营养物质，可以作为饲料原料再次利用，具有较高的利用价值[4-9]。目前，菌糠在动物生产中的利用方式分为：直接使用和发酵后使用。实际生产中发现，直接使用菌糠饲喂动物，适口性较差，影响采食量，动物生产性能下降，生产中存在弊端[10-11]。近年来，有效利用菌糠饲料资源成为饲料行业发展的热点与难点[12-13]。研究表明，利用微生物制剂发酵菌糠成为非常规饲料原料利用的趋势，已有学者开展微生物发酵方面的研究[14-17]。但单一或多种菌株发酵菌糠饲料报道相对较多[18-19]，使用菌酶协同发酵菌糠原料的研究相对较少。本试验以香菇菌糠为底物，添加常用的微生物菌种及酶制剂，研究微生物发酵过程及菌酶协同作用对发酵香菇菌糠的影响，优化菌酶协同作用对香菇菌糠发酵工艺的参数，以期为提高香菇菌糠的饲料利用价值提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验原料香菇菌糠由和田当地香菇栽培基地提供。培养基组成为：核桃树木屑79%、麸皮20%、石灰1%，水分含量约55%~60%。菌糠原料营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T001表1菌糠的营养水平（干物质基础）项目数值pH值5.46干物质/%43.56中性洗涤纤维/%55.43酸性洗涤纤维/%46.22木质素/%22.91粗脂肪/%1.23粗蛋白/%9.92粗灰分/%9.231.1.2试验菌种及酶制剂植物乳杆菌、黑曲霉、嗜酸乳杆菌、布氏乳杆菌和产朊假丝酵母菌，均购自北京精准动物营养研究中心；纤维素酶、木聚糖酶均购自宁夏夏盛实业集团有限公司。1.1.3仪器设备电子天平、立式压力蒸汽灭菌器、生物安全柜、电热恒温培养箱等。1.2试验方法菌糠发酵参数优化采用L16(45)正交试验，5个试验因素分别为A玉米添加量、B底物水分含量、C菌酶组成、D菌酶接种量和E发酵时间，每个因素4个水平。菌酶组成见表2。正交试验设计见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T002表2菌酶组成组别菌种组成菌比例酶组成酶比例菌酶比1布氏乳杆菌∶产朊假丝酵母∶嗜酸乳杆菌∶黑曲霉6∶6∶2∶1木聚糖酶∶纤维素酶2∶50.007∶12布氏乳杆菌∶产朊假丝酵母∶嗜酸乳杆菌6∶6∶2木聚糖酶∶纤维素酶2∶50.007∶13布氏乳杆菌∶产朊假丝酵母∶植物乳杆菌6∶6∶2木聚糖酶∶纤维素酶0∶50.010∶14布氏乳杆菌∶产朊假丝酵母∶植物乳杆菌∶黑曲霉6∶6∶2∶1木聚糖酶∶纤维素酶2∶50.007∶110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T003表3正交试验设计水平A玉米添加量/%B水分含量/%C菌酶组成D菌酶接种量/%E发酵时间/d145410.730255821.440366232.150476642.860将不同菌种加入无菌去离子水中进行活化，制备复合菌液，依接种量的不同而分别接种到底物中，酶制剂直接添加到底物中。按照0.8%比例加入硫酸铵，添加不同水平的玉米粉，调节水分含量后，玻璃棒混合均匀，密封，每个处理3个重复。在室温下发酵后开袋检测。1.3测定指标及方法1.3.1感官评价发酵产物感官评价参照德国农业协会（DLG）[20]方法。通过对气味、质地和色泽等指标打分，分为优良（16~20分）、尚好（10~15分）、中等（5~9分）、腐败（0~4分）４个等级。1.3.2化学成分分析干物质含量参照GB/T 6435—2006采用烘干法进行检测；粗蛋白含量（CP）参照GB/T 6432—94采用凯氏定氮法进行检测；中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量采用滤袋法使用ANKOM 2000i全自动纤维分析仪进行检测；每个样本称10 g放入锥形瓶，加入90 mL蒸馏水，4 ℃冰箱中静置24 h，取上清液测定pH值。1.3.3发酵产品综合评分分析使用Fzuuy数学中隶属函数法对感官指标以及发酵品质综合评价。与发酵品质呈正相关的指标（感官评价指标、CP含量）采用公式（1）计算，与发酵品质呈负相关的指标（pH值、NDF和ADF含量）采用公式（2）计算，计算出各项指标隶属函数平均值。Fij+=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)(1)Fij-=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)(2)式中：Fij为第i个处理第j个指标时的隶属度；Xij为第i个处理第j个指标的测定值；Xmax、Xmin为每个供试对象中第j个项指标的最大值和最小值[21]。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel进行汇总，SPSS 20.0软件分中One-way ANOVA进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1香菇菌糠发酵后对感官指标的影响（见表4）由表4可知，A2水平的评分值显著高于A1（P0.05）；B3水平的评分极显著高于B4（P0.01）；C2的评分极显著高于其他水平组（P0.01）；D4水平的评分极显著高于D3（P0.01），显著高于D2、D3水平（P0.05）；E1水平的评分极显著高于E3、E4水平（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T004表4香菇菌糠发酵后对感官指标的影响水平ABCDE117.09±0.12b17.65±0.12Aa17.13±0.12Bb17.53±0.12Aab17.75±0.12Aa217.50±0.12a17.71±0.12Aa17.98±0.12Aa17.38±0.12Ab17.60±0.12ABa317.40±0.12ab17.87±0.12Aa17.17±0.12Bb16.63±0.12Bc16.79±0.12Cc417.33±0.12ab16.08±0.12Bb17.04±0.12Bb17.77±0.12Aa17.17±0.12BCb注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2香菇菌糠发酵后对pH值的影响（见表5）由表5可知，B1、B2、C1、C2水平的pH值极显著高于其他水平（P0.01）；E2、E3、E4各水平间的pH值均极显著高于E1（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T005表5香菇菌糠发酵后对pH值的影响水平ABCDE13.92±0.013.97±0.01Aa3.97±0.01Aa3.93±0.013.80±0.01Dd23.94±0.013.97±0.01Aa3.98±0.01Aa3.93±0.013.85±0.01Cc33.92±0.013.88±0.01Bb3.87±0.01Bb3.93±0.013.93±0.01Bb43.92±0.013.87±0.01Bb3.87±0.01Bb3.91±0.014.11±0.01Aa2.3香菇菌糠发酵后对中性洗涤纤维的影响（见表6）由表6可知，A3水平的中性洗涤纤维含量极显著低于其他水平（P0.01）；B1水平的中性洗涤纤维含量极显著高于其他水平（P0.01）；C4水平的中性洗涤纤维含量极显著低于C3（P0.01）；D4水平的中性洗涤纤维含量显著低于D1（P0.05）；E4水平的中性洗涤纤维含量极显著低于其他水平（P0.01），E3水平的中性洗涤纤维含量极显著低于E1和E2水平（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T006表6香菇菌糠发酵后对中性洗涤纤维的影响水平ABCDE153.08±0.58Aa52.72±0.58Aa50.04±0.58ABbc51.67±0.58a55.46 ±0.58Aa249.70±0.58Bb49.59±0.58Bb51.06±0.58ABab50.05±0.58ab56.90±0.58Aa345.02±0.58Cc50.33±0.58Bb51.73±0.58Aa50.53±0.58ab50.85±0.58Bb454.27±0.58Aa49.44±0.58Bb49.26±0.58Bc49.85±0.58b38.88±0.58Cc2.4香菇菌糠发酵后对酸性洗涤纤维的影响（见表7）由表7可知，A3水平的酸性洗涤纤维含量极显著低于其他水平（P0.01）；B1水平的酸性洗涤纤维含量极显著高于B4水平（P0.01）；C3水平的酸性洗涤纤维含量显著高于C1和C4水平（P0.05）；D1水平的酸性洗涤纤维含量显著高于D2和D4水平（P0.05）；E4水平的酸性洗涤纤维含量最低，极显著低于其他水平（P0.01），E2水平的酸性洗涤纤维含量显著极高于E3和E4水平（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T007表7香菇菌糠发酵后对酸性洗涤纤维的影响水平ABCDE141.06±0.65Aa40.83±0.65Aa38.11±0.65b40.67±0.65a42.10±0.65ABb238.17±0.65Bb38.98±0.65ABb39.65±0.65ab38.14±0.65b44.08±0.65Aa335.09±0.65Cc39.25±0.65ABab40.39±0.65a39.52±0.65ab40.19±0.65Bc442.26±0.65Aa37.52±0.65Bb38.45±0.65b38.26±0.65b30.22±0.65Cd2.5香菇菌糠发酵后对粗蛋白含量的影响（见表8）由表8可知，A3水平的粗蛋白含量极显著高于其他水平（P0.01）；B4水平的粗蛋白含量极显著高于B1水平（P0.01），B2的粗蛋白含量显著高于B3水平（P0.05）；C4水平的粗蛋白含量极显著高于C1和C3水平（P0.01）；D4水平的粗蛋白含量极显著高于D1和D2水平（P0.01），D1水平的粗蛋白含量极显著低于D1和D3水平（P0.01）；E1水平的粗蛋白含量显著高于E2水平（P0.05），E3水平的粗蛋白含量显著高于E2水平（P0.05），E2水平和E4水平间粗蛋白含量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T008表8香菇菌糠发酵后对粗蛋白含量的影响水平ABCDE17.88±0.07Bb7.55±0.07Bc7.82±0.07Bb7.58±0.07Cc8.11±0.07a27.66±0.07Bb8.23±0.07Aa7.98±0.07ABab7.95±0.07Bb7.82±0.07c38.63±0.07Aa8.00±0.07Ab7.89±0.07Bb8.09±0.07ABab8.07±0.07ab47.71±0.07Bb8.11±0.07Aab8.20±0.07Aa8.27±0.07Aa7.89±0.07bc2.6菌糠发酵品质综合评价（见表9~表11）由表9可知，分值越高发酵品质越好，反之越差。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T009表9菌糠发酵品质综合评价组别pH值感官评定中性洗涤纤维酸性洗涤纤维粗蛋白平均值10.531.310.040.130.060.2820.370.790.290.370.290.3430.451.050.630.610.780.6040.140.750.780.870.430.5250.050.530.750.780.390.4560.390.880.410.420.260.3970.441.050.310.350.620.4580.491.280.120.140.570.3990.831.550.090.130.430.45100.911.810.260.330.480.58110.080.610.990.910.610.58120.461.070.160.170.160.30130.481.280.420.390.790.54140.050.290.830.830.250.42150.931.730.540.640.950.78160.801.410.060.040.220.36由表10可知，菌酶组成、菌酶接种量、玉米添加量、底物水分含量和发酵时间5个因素对香菇菌糠发酵的影响均较大，差异极显著（P0.01）。各因素对香菇菌糠发酵效果的影响次序为ABCDE，即玉米添加量、底物水分含量、菌酶组成、菌酶接种量和发酵时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T010表10方差分析变异来源平方和自由度均方F值显著性A0.32030.10729.0950.000B0.19430.06517.6580.000C0.08830.0298.0080.000D0.08730.0297.8800.000E0.08230.0277.4370.001误差0.117320.004由表11可知，A3水平的综合评分最高，极显著高于其他水平（P0.01）；B4水平的综合评分最高，极显著高于B1和B2水平（P0.01）；C4水平的综合评分最高，极显著高于C1和C2水平（P0.01）；D4水平的综合评分最高，显著高于D2和D3水平（P0.05），极显著高于D1水平（P0.01）；E1水平的综合评分最高，极显著高于E2水平（P0.01），显著高于E3水平（P0.05），E4水平和E1水平差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.013.T011表11不同处理水平对香菇菌糠发酵品质的影响水平ABCDE10.43±0.02Bb0.36±0.02Cc0.43±0.02Bbc0.40±0.02Bc0.51±0.02Aa20.43±0.02Bb0.46±0.02Bb0.42±0.02Bc0.47±0.02ABb0.40±0.02Bc30.60±0.02Aa0.50±0.02ABab0.48±0.02ABb0.47±0.02ABb0.46±0.02ABb40.39±0.02Bb0.54±0.02Aa0.53±0.02Aa0.52±0.02Aa0.49±0.02Aab3讨论3.1玉米添加量对香菇菌糠发酵品质的影响发酵过程中，可溶性碳水化合物含量过低会影响饲料的调制和贮存[22]。良好的发酵条件是成功制作发酵饲料的关键，提供充足的含糖量及适宜的含水量是饲料发酵成功的决定性因素[23]。因此，发酵底物中添加适当比例的玉米能够提供发酵过程所需的还原性糖，从而提高发酵品质。赵祎等[24]研究木耳菌糠发酵饲料，结果表明，玉米粉添加量对纤维素和半纤维素降解率的影响较大。本试验表明，随着玉米添加量的增加，纤维含量呈降低的趋势；玉米添加量为6%时，香菇菌糠的发酵较为适宜。3.2底物水分含量对香菇菌糠发酵品质的影响底物水分含量是固体发酵饲料中一个重要的工艺参数。随着发酵时间的延长，水分含量达到稳定状态，乳酸菌数量达到平衡状态，发酵饲料品质达到更优。陈超等[25]研究微贮金针菇与水分的关系，结果发现，随微贮时间的增加，水分含量逐渐达到稳定，控制在60%~62%。本试验中，水分含量为66%时，综合评分最高，与水分含量为62%无显著差异。因此，菌糠发酵过程中，底物水分含量可选择66%或62%。3.3菌酶组成对香菇菌糠发酵品质的影响研究发现，利用多种菌株协同发酵技术在理论上能够表现不同菌株优良的发酵特点，实际生产中，各个菌株间仍然或者可能存在某些拮抗作用[26]，使用米曲霉和干酪乳杆菌发酵豆粕，干酪乳杆菌影响抗原蛋白的降解效果[27]。添加酶制剂能够通过菌酶协同发酵，可以增强微生物对大分子营养物质的吸收利用效果。张安荣[28]研究菌酶协同发酵杏鲍菇菌糠工艺优化条件，结果发现，经菌酶协同处理，中性洗涤纤维含量显著降低，粗蛋白含量显著增加。本试验条件下，可选取C4水平的菌酶组成作为菌糠发酵饲料的微生物添加剂使用，即添加嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母、植物乳杆菌、黑曲霉、纤维素酶、木聚糖酶等。3.4菌酶接种量对香菇菌糠发酵品质的影响适宜的菌酶接种量对发酵样品处理和维持发酵进程会产生较大影响。接种量过低，微生物生长量不足，可能导致底物发酵不充分；反之，则微生物繁殖过度，可能导致菌糠发酵过程被抑制。本研究中，当接种量达到2.8%时，综合评价分值最高。接种量0.7%时，综合评价分值最低，说明菌种接种量可能偏低，导致微生物生长数量不足。与刘世操等[17]研究结果保持一致。本研究条件下，菌酶接种量可选择2.8%接种水平。3.5发酵时间对香菇菌糠发酵品质的影响微生物发酵饲料中发酵时间同样尤为重要。菌糠发酵时间过短，导致底物发酵不彻底；发酵时间过长，底物中的微生物可能发生化合作用，造成菌糠中某些物质的变性或分解，营养价值降低。本研究中，当发酵时间为30 d时，综合评分最高，发酵效果相对较好。因此，本试验条件下，发酵时间可选择30 d，与陈鑫珠等[29]研究结果保持一致。3.6发酵工艺参数优化对香菇菌糠发酵品质的影响使用菌糠制作发酵饲料应选择适宜的发酵条件[30]。菌糠原料的差异性较大，不同菌糠的底物组成也不同。因此，菌糠发酵后的实际应用效果也存在很大差异。生产中应考虑多方面因素进而综合利用。菌种及酶制剂的组合、菌酶添加量、糖原物质玉米粉的添加、水分含量以及发酵时间等，将这些因素综合考虑后，进行发酵工艺参数的优化，选择适宜的发酵条件，满足菌糠发酵的实际情况。本试验中，利用隶属函数值法，对相关指标综合分析，筛选香菇菌糠的最佳发酵工艺参数为：玉米添加量6%，底物水分含量66%，菌酶组成为布氏乳杆菌、产朊假丝酵母、植物乳杆菌、黑曲霉、纤维素酶及木聚糖酶，菌酶接种量2.8%，发酵时间30 d。4结论菌酶协同对香菇菌糠发酵品质影响因素次序为玉米添加量底物水分含量菌酶组成菌酶接种量发酵时间。确定香菇菌糠最佳发酵工艺参数为A3B4C4D4E1，即玉米添加量6%，底物水分含量66%，菌酶组成为布氏乳杆菌、产朊假丝酵母、植物乳杆菌、黑曲霉、纤维素酶及木聚糖酶，菌酶接种量2.8%，发酵时间30 d。