发酵全混合日粮（FTMR）是全混合日粮（TMR）技术和青贮技术结合制成的营养价值高、便于长期贮存的优质日粮[1-2]。青贮技术能够有效保存青绿饲料中的营养成分，但多量饲喂易造成采食量下降、干物质不足和酸中毒等[3-4]。TMR营养均衡，但易变质腐败，不宜长期贮存，投资成本较高[2]。FTMR具有适宜的湿度（40%~50%），良好的适口性，能够有效抑制腐败菌的大量繁殖，降低霉菌毒素及抗营养因子含量[5-7]。研究表明，FTMR饲喂肉羊能够有效提高饲料消化率和日增重，降低料重比和瘤胃酸中毒[8-10]。FTMR制作过程中，使用乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等益生菌能够有效利用各菌种产生的代谢酶及消化酶，降解原料中抗营养因子和毒素含量，提升活性营养因子含量[5,11]。产朊假丝酵母和酿酒酵母能够提供优质菌体蛋白，从而提高饲料蛋白水平[12]。乳酸菌、枯草芽孢杆菌可以降低饲料中的霉菌毒素水平[13-14]。曲霉属益生菌可以降解饲料中的木质纤维素[15]。目前，各菌种间相互作用的研究不够深入，能够利用的高效、低成本发酵菌种组合仍较少。本试验旨在筛选适用于肉羊生产的FTMR最佳益生菌组合，为其在肉羊生产中的广泛应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1FTMR配方试验参照NRC标准，按照20 kg体重、150 g日增重条件对育肥山羊饲料配方进行设计，提供由英国泰邦公司生产的专用矿物质微量元素舔砖供羊自由舔舐。FTMR日粮组成及营养水平见表1。营养成分参考《中国饲料营养成分价值表 2020年第31版》进行计算。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.014.T001表1FTMR日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米35.00消化能/(MJ/kg)10.95麦麸2.00粗蛋白/%13.63青贮玉米37.20粗脂肪/%2.90豆粕4.00中性洗涤纤维/%23.94苜蓿干草20.00酸性洗涤纤维/%12.57磷酸氢钙0.25粗灰分/%6.50食盐1.00钙/%0.57石粉0.05总磷/%0.44小苏打0.50注：营养水平均为计算值。1.1.2菌种酿酒酵母（2×1010 CFU/g）、枯草芽孢杆菌（1×1011 CFU/g）、黑曲霉（3×109 CFU/g）均购自山东蔚蓝生物科技有限公司；产朊假丝酵母（8×109 CFU/g）购自云南力莲生物公司；德氏乳杆菌乳酸亚种（1×1010 CFU/g）均购自陕西冠晨生物科技有限公司；两歧双歧杆菌（1×1010 CFU/g）购自陕西飞米生物科技有限公司；米曲霉（5×109 CFU/g）购自山东济宁玉园生物公司。所有菌种均在5 ℃以下密封保存，使用时按照菌种与培养基1∶2质量比例添加，并加入少量水分进行活化。1.2试验方法1.2.1试验设计试验设置8组菌种组合。A组：酿酒酵母+枯草芽孢杆菌+德氏乳杆菌乳酸亚种+黑曲霉+米曲霉；B组：产朊假丝酵母+枯草芽孢杆菌+德氏乳杆菌乳酸亚种+黑曲霉+米曲霉；C组：酿酒酵母+枯草芽孢杆菌+两歧双歧杆菌+黑曲霉+米曲霉；D组：产朊假丝酵母+枯草芽孢杆菌+两歧双歧杆菌+黑曲霉+米曲霉；E组：酿酒酵母+产朊假丝酵母+枯草芽孢杆菌+德氏乳杆菌乳酸亚种+黑曲霉+米曲霉；F组：酿酒酵母+产朊假丝酵母+枯草芽孢杆菌+两歧双歧杆菌+黑曲霉+米曲霉；G组：酿酒酵母+黑曲霉+米曲霉；H组：酿酒酵母。在室温、底物含水量40%的条件下，对全混合日粮进行固态发酵，同时设置不添加菌剂的TMR I组作空白对照，每组3个重复。FTMR各组菌种添加比例见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.014.T002表2FTMR各组菌种添加比例组别酿酒酵母产朊假丝酵母枯草芽孢杆菌德氏乳杆菌乳酸亚种两歧双歧杆菌黑曲霉米曲霉A组0.8600.430.4300.430.43B组00.860.430.4300.430.43C组0.8600.4300.430.430.43D组00.860.4300.430.430.43E组0.860.860.430.4300.430.43F组0.860.860.4300.430.430.43G组0.8600000.430.43H组0.86000000I组0000000%1.2.2样品处理按照TMR配方比例准确称量饲料原料，按照干草、精料、青贮料的顺序混匀。将不同菌种组合的菌活化后，与TMR原料进行充分混合，加入约5.5%的水，将含水量调整为40%。每组均匀分装3袋，每袋100 g，室温下抽真空密封发酵8 d，测定营养成分及霉菌毒素含量。1.3测定指标及方法1.3.1常规营养成分及霉菌毒素的测定真蛋白的测定采用张丽英[16]方法，在碱性溶液中使用硫酸铜沉淀蛋白质，将纯蛋白质与非蛋白含氮物分离，使用凯氏定氮法测定沉淀中的蛋白质含量。中性洗涤纤维（NDF）的测定参照GB/T 20806—2006。饲料中的呕吐毒素（DON）、黄曲霉素（AFB1）采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）检验，往预先包被DON、AFB1抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，通过底物TMB显色，使用酶标仪（瑞士TECAN Infinite F50）在450 nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。ELISA试剂盒购自上海优选生物科技有限公司。1.3.2pH值将FTMR待检样品剪碎，每个重复准确称量15 g样品于广口三角瓶，加入450 mL二级纯水浸润，4 ℃摇晃浸提24 h，使用2~3层纱布过滤[17]，使用Sartorius pH计（PB-10）测定pH值。1.4数据统计与分析试验数据采用SAS 8.1软件进行单因素方差统计分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同菌种组合对FTMR常规营养成分的影响（见表3）由表3可知，除A组外，其他各组FTMR真蛋白含量均显著高于I组（P0.05），F组FTMR真蛋白含量最高，显著高于除E组外的其他组（P0.05），E组FTMR真蛋白含量显著高于B组、H组、C组、G组、I组和A组（P0.05），D组FTMR真蛋白含量显著高于H组、C组、G组、I组和A组（P0.05），B组FTMR真蛋白含量显著高于H组、C组、G组、I组和A组（P0.05），H组FTMR真蛋白含量显著高于G组、I组和A组（P0.05），C组FTMR真蛋白含量显著高于G组、I组和A组（P0.05），G组FTMR真蛋白含量显著高于I组和A组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.014.T003表3不同菌种组合对FTMR常规营养成分的影响组别真蛋白中性洗涤纤维A组14.72±0.15f18.20±0.22eB组16.27±0.20c18.81±0.25deC组15.50±0.10d29.56±0.65bD组16.53±0.05bc29.62±0.18bE组16.81±0.08ab18.68±0.55deF组16.97±0.10a27.43±0.91cG组15.11±0.23e19.61±0.75dH组15.64±0.19d18.93±0.37deI组14.73±0.25f32.10±0.44a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%A组至H组FTMR中性洗涤纤维含量均显著低于I组（P0.05）。A组FTMR中性洗涤纤维含量最低，显著低于G组、F组、C组和D组（P0.05）。E组、B组、H组FTMR中性洗涤纤维含量均显著低于F组、C组和D组（P0.05）。G组FTMR中性洗涤纤维含量显著低于F组、C组和D组（P0.05），F组FTMR中性洗涤纤维含量显著低于C组和D组（P0.05）。2.2不同菌种组合对FTMR霉菌毒素含量的影响（见表4）由表4可知，除G组和F组外，其他各组FTMR黄曲霉毒素含量均显著低于I组（P0.05）。E组FTMR黄曲霉毒素含量显著低于B组、D组、H组、C组和A组（P0.05），B组FTMR黄曲霉毒素含量显著低于D组、H组、C组和A组（P0.05），D组FTMR黄曲霉毒素含量显著低于H组、C组和A组（P0.05），H组和C组FTMR黄曲霉毒素含量显著低于A组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.014.T004表4不同菌种组合对FTMR霉菌毒素含量的影响组别黄曲霉毒素呕吐毒素A组6.29±0.24c56.07±4.58eB组4.30±0.02f122.60±2.25aC组5.67±0.15d98.43±6.12bD组4.79±0.17e77.40±5.04cE组3.59±0.22g83.73±4.03cF组7.84±0.16a68.13±5.76dG组7.55±0.21a33.90±8.90fH组5.46±0.08d27.97±4.84fI组7.01±0.26b98.43±4.24bμg/kg除B组和C组外，其他各组FTMR呕吐毒素含量均显著低于I组（P0.05）。H组和G组FTMR呕吐毒素含量显著低于A组、F组、D组和E组（P0.05），A组FTMR呕吐毒素含量显著低于F组、D组和E组（P0.05），F组FTMR呕吐毒素含量显著低于D组和E组（P0.05）。2.3不同菌种组合对FTMR pH值的影响（见表5）由表5可知，除B组外，其他各组FTMR pH值均略低于I组，G组和A组FTMR pH值最低，其次是D组和F组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.014.T005表5不同菌种组合对FTMR中pH值的影响组别pH值A组5.87±0.29B组6.21±0.47C组6.06±0.10D组5.97±0.10E组6.16±0.20F组5.98±0.03G组5.85±0.14H组6.02±0.13I组6.17±0.013讨论3.1不同菌种组合对FTMR常规营养成分的影响饲料中的粗蛋白质由真蛋白和非蛋白两部分中的含氮物质组成。非蛋白质部分主要包括游离氨基酸、氨和硝酸盐等，不能反映饲料蛋白质的可利用价值[18]。本研究采用真蛋白质含量评定FTMR的营养价值。中性洗涤纤维是植物性饲料经中性洗涤剂分解后的剩余物，适口性差、消化率低。饲料中中性洗涤纤维含量越多，被动物吸收利用的营养成分越少[19]。本研究显示，除A组外，其他组菌种组合的FTMR真蛋白含量均显著高于对照组，效果最好的是F组和E组，其次是D组和B组；与其他组相比，F组、E组、D组和B组均含有产朊假丝酵母及枯草芽孢杆菌，F组、E组和D组、B组相比，均含有酿酒酵母。因此，产朊假丝酵母在提高FTMR真蛋白含量中发挥主要作用，酿酒酵母有协助增强的功能。沈维亮等[20]将酿酒酵母、产朊假丝酵母以1∶1比例配合发酵木薯渣，发现蛋白含量提升显著高于两种菌单独添加时的效果。吕文竹等[21]研究发现，产朊假丝酵母+芽孢杆菌发酵组合中酸溶蛋白含量显著高于其他组合（如植物乳杆菌+枯草芽孢杆菌）发酵后的含量。张丽芝等[22]研究发现，添加有产朊假丝酵母的菌种组合提高饲料真蛋白含量的效果要优于其他组合。张志国等[23]和杨文艳等[24]研究发现，混合益生菌组比单独酿酒酵母组更能够有效抑制铵态氮的产生，铵态氮含量越高，饲料中蛋白质被降解的程度越高，饲料品质越差。本研究显示，菌种组合FTMR的中性洗涤纤维含量均显著低于对照组，效果最好的是A组、E组、B组和H组，且B组优于D组，E组优于F组，原因主要是德式乳杆菌乳酸亚种和两歧双歧杆菌的区别。因此，酿酒酵母和产朊假丝酵母能够有效降低FTMR中的中性洗涤纤维含量，德式乳杆菌乳酸亚种有协助增强降低FTMR中性洗涤纤维含量的功能。张志国等[23]研究发现，在发酵第7~30 d，酵母复合益生菌（酵母菌复合物+乳酸菌+枯草芽孢杆菌+蜡样芽孢杆菌）降低FTMR中性洗涤纤维含量的效果优于不含酵母复合益生菌组合的效果（纤维分解菌复合物+乳酸菌+枯草芽孢杆菌+蜡样芽孢杆菌）。王晓力等[25]研究发现，利用产朊假丝酵母、里氏木霉和黑曲霉发酵苹果渣和啤酒糟等饲料能够有效降低中性洗涤纤维含量，降幅为9%。余枭等[26]研究发现，使用酿酒酵母及乳酸菌组合发酵降低秸秆饲料中NDF含量的效果显著优于乳酸菌单独发酵效果。Lee等[27]研究发现，在青贮苜蓿中添加乳酸杆菌能够显著降低NDF含量。因此，综合真蛋白和中性洗涤纤维两个指标，FTMR使用最佳发酵菌种组合为E组。3.2不同菌种组合对FTMR霉菌毒素含量的影响饲料中霉菌毒素是由饲料内霉菌产生的有毒代谢产物，在饲料作物生长、收获和贮藏等过程中均可产生。饲料中霉菌毒素能够使蛋白质、纤维素等有机物严重损失，饲喂动物后会严重影响动物的健康，危害较大，且长见霉菌毒素的主要有黄曲霉毒素，其次是呕吐毒素和玉米赤霉烯酮等[28-29]。微生物解毒是降低饲料中霉菌毒素的有效方法，且不存在药物残留问题。发酵饲料中的乳酸杆菌、芽孢杆菌和布氏乳杆菌等有益微生物能够不同程度降低饲料中的霉菌毒素含量[28-31]。本研究显示，除G组和F组外，其他各组FTMR黄曲霉毒素含量均显著低于对照组，效果最好的是E组和B组；E组优于F组和B组优于D组。因此，菌种组合中德式乳杆菌乳酸亚种和产朊假丝酵母可能发挥降低FTMR中黄曲霉毒素含量的主要功能。Silva等[32]研究发现，德式乳杆菌和酵母菌组合能够有效降低花生秧中的黄曲霉毒素含量。Ragoubi等[33]研究发现，德式乳杆菌乳酸亚种能够有效降解饲料和食品中的黄曲霉素。Bzducha-Wróbel等[34]研究发现，产朊假丝酵母能够有效降低饲料和食品中的黄曲霉毒素含量。本试验中，F组黄曲霉毒素含量高于对照组，可能与两歧双歧杆菌吸附黄曲霉毒素能力弱，并在一定程度上影响其他吸附能力强的菌种的增殖有关；G组黄曲霉毒素含量高于对照组，可能与G组中较高的黑曲霉和米曲霉含量有关；G组中较高的黑曲霉和米曲霉含量可能也在一定程度上影响酿酒酵母的增殖，降低酿酒酵母吸附和降低黄曲霉毒素的能力。本研究中，除B组和C组外，其他各组FTMR呕吐毒素含量均显著低于I组，效果最好的是H组、G组和A组，均含有酿酒酵母。A组优于C组，可能与德式乳杆菌乳酸亚种较强的吸附降低呕吐毒素能力有关。因此，菌种组合中酿酒酵母和德式乳杆菌乳酸亚种可能发挥降低FTMR中呕吐毒素含量的主要功能。Chlebicz等[35]使用6株酿酒酵母处理呕吐霉素（DON），发现24 h后DON浓度下降22%~43%；使用乳杆菌属菌种处理样本，将菌种与样品共培养24 h后降解了19%~39%的DON。Ragoubi等[33]研究发现，德式乳杆菌乳酸亚种也能够有效降低饲料中呕吐毒素的含量。本试验中，B组呕吐毒素含量显著高于对照组，可能与产朊假丝酵母吸附呕吐毒素能力弱或干扰其他具有较强吸附能力菌种的增殖有关；C组呕吐毒素含量与对照组不显著，可能与两歧双歧杆菌吸附呕吐毒素能力弱或干扰其他具有较强吸附能力菌种的增殖有关；FTMR中菌种组合pH值变动范围为5.87~6.28，平均为6.02，且菌种组合FTMR的pH值较高，因为饲料中较低的含水量（40%）和各菌种组合中较高比例的酿酒酵母。研究表明，FTMR中保持较低含水量，即使pH值均维持在6.0左右，也能够保证发酵的成功[17]。酵母菌是一种兼性厌氧菌，适当的酵母菌含量可以避免发酵初期消耗过多的底物营养，导致代谢副产物的过多积累而影响有益微生物生长，酵母菌还能够有效促进纤维素的降解[17,36]。因此，综合黄曲霉毒素和呕吐毒素两个检测指标，FTMR用最佳发酵菌种组合为E组。4结论不同菌种组合能够有效提高FTMR的饲料品质和降低霉菌毒素的含量，选用E组制备FTMR效果最佳。