随着我国生猪养殖的规模化发展，高生产成绩是关键目标，乳仔猪阶段生产成绩至关重要。在品种、环境、管理一致的前提下，通过调控饲料营养增强仔猪的消化吸收能力和营养物质的转化沉积效率是提高生产成绩的有效措施。仔猪肠道发育不完善，断奶和换料等应激进一步造成肠道损伤，导致消化吸收能力减弱。研究表明，2~6个氨基酸组成的小分子活性肽以完整形式被机体吸收，可促进乳仔猪肠道生长发育，降低肠道上皮细胞间通透性，降低氧化损伤[1]，促进矿物质元素吸收[2-3]，从而提高仔猪的消化吸收能力[4-5]。因此，蛋白原料中2~6肽的含量以及功能是反映蛋白原料品质的关键指标。饲料中营养物质消化吸收速率直接影响沉积效率，且营养素之间的消化吸收速率需匹配。研究表明，饲喂后1.5 h能量消化产物（葡萄糖）与蛋白质消化产物（肽和氨基酸）在血液中同时达到最高浓度，实现了蛋白和能量两大营养素沉积效率的最大化[6-7]。因此，研究饲料蛋白原料的消化速率尤为必要。本文采用体外胃-胰液两步法在不同时间点采集消化液测定蛋白含量，评价蛋白质的消化速率[8]。评价蛋白原料的功能通常采用细胞模型、小鼠模型、动物生产应用模型等方法[9]，但上述方法均存在操作难、费用高、影响因素多等问题[10]。借鉴食品领域的实验室检测方法，应用ABTS法[11]和持钙检测法[12]能够快速、低成本、稳定地评价抗氧化能力和促进矿物元素吸收能力，为仔猪饲料配方中蛋白原料的选择和应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料蒸汽鱼粉（粗蛋白含量66%，秘鲁进口）、去皮豆粕（粗蛋白含量46%，益海防城港大豆工业有限公司）、大豆浓缩蛋白（粗蛋白含量65%，益海防城港大豆工业有限公司）、膨化大豆（粗蛋白含量35%，益海防城港大豆工业有限公司）、酵母水解物（粗蛋白含量52%，安琪酵母股份有限公司）、发酵豆粕（粗蛋白含量52%，益海防城港大豆工业有限公司）、大豆酶解蛋白（粗蛋白含量56%，成都美溢德生物技术有限公司）。7种仔猪料中常用蛋白原料，粉碎过60目标准筛。秘鲁蒸汽鱼粉、去皮豆粕、大豆浓缩蛋白、膨化大豆、酵母水解物、发酵豆粕、大豆酶解蛋白测定蛋白消化速率；秘鲁蒸汽鱼粉、酵母水解物、发酵豆粕、大豆酶解蛋白测定2~6肽含量、抗氧化能力以及持钙能力。乙腈（色谱纯，迈瑞达）；三氟乙酸（色谱纯，Alfa Asear）；杆菌肽锌、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽（上海生工生物工程股份有限公司）；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法，碧云天生物技术有限公司）；NaOH（分析纯，天津致远化学试剂有限公司）；CaCl2（分析纯，天津滨海科迪化学试剂有限公司）；NaH2PO4（分析纯，天津致远化学试剂有限公司）；胃蛋白酶（15 000 U/mg，上海源叶生物科技有限公司）；胰蛋白酶（2 500 U/mg，上海源叶生物科技有限公司）；HCl（分析纯，成都金山化学试剂有限公司）、NaOH（分析纯，天津致远化学试剂有限公司）。1.2试验仪器高效液相色谱仪（配有紫外检测器）、酶标仪、恒温磁力搅拌器、pH计、全自动凯氏定氮仪（Kjeltec 8400，FOSS）。1.3测定指标及方法1.3.1蛋白原料体外蛋白消化速率参照GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》，测定试样中的含氮量，结果乘以换算系数6.25，计算粗蛋白质含量。采用体外胃-胰蛋白酶两步法测定7种常用蛋白原料。称取1.5 g样品于具塞三角瓶，加入150 mL去离子水混匀，6 mmol/L HCl调节pH值至2.0，加入30 mg的胃蛋白酶，39 ℃、120 r/min空气浴振荡处理4 h。2 mmol/L NaOH 调节pH值至7.5，加入30 mg的胰蛋白酶，39 ℃，120 r/min摇床振荡处理，分别在30、60、90、120、150、180、210、240、300、360 min[13]取10 mL消化液并加入10 mL 15%三氯乙酸终止反应，室温沉淀30 min，4 000 g×离心10 min。取上清液2 g于消化管，凯氏定氮法测定上清液的含氮量，每个样品每个时间点设置3个平行[14]。蛋白质体外消化率=上清液中氮含量/(样品重×样品粗蛋白质含量)×100%（1）1.3.2蛋白原料中2-6肽含量参照GB/T 22492—2008测定肽分子量分布，标品分别用流动相配制成质量浓度为1 g/L的肽标准品溶液，按一定比例混合，孔径0.2~0.5 µm有机相膜过滤后进样，得到标准品的色谱图。利用GPC软件分析以相对分子质量的对数对保留时间作图或作线性回归得到相对分子质量校正曲线及方程。称取样品10 mg于10 mL容量瓶，加入流动相定容，超声振荡10 min，样品充分溶解混匀，加流动相稀释至刻度，孔径0.2~0.5 µm有机相膜过滤，滤液分析。1.3.3蛋白原料抗氧化能力采用蒸馏水稀释标准品，10 mmol/L Trolox标准溶液稀释成0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50 mmol/L。样品采用蒸馏水稀释超声处理，96孔板的每个检测孔中加入20 μL过氧化物酶工作液。对照孔中加入10 μL蒸馏水或PBS等适当溶液；标准曲线检测孔内加入10 μL各种浓度的Trolox标准溶液；样品检测孔内加入10 μL各种样品，轻轻混匀；每个孔内加入170 μL ABTS工作液，轻轻混匀。室温孵育6 min后测定A414。计算标准品每个点的ΔA414：ΔA414=A414对照-A414标准品，采用ΔA414和Trolox标准溶液浓度制作标准曲线图。1.3.4蛋白原料持钙能力100 mL的反应体系中加入NaH2PO4和样品，二者在反应体系中的浓度分别为8 mmol/L和100 g/L。将溶液加热至38 ℃保温，加入CaCl2，反应体系中CaCl2浓度为8 mmol/L。加入0.01 mol/L的NaOH溶液，在2 min内将反应体系的pH值调节至7.2，随后不断加入0.01 mol/L NaOH，反应体系的pH值维持在7.2。从第2 min开始，每隔5 min记录1次NaOH的消耗量，持续1 h。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），P0.05表示差异显著，采用GPC软件分析蛋白分子量分布。持钙能力相关数据使用Excel 2007软件绘制折线图。2结果与分析2.1不同蛋白原料的体外蛋白消化速率（见表1）由表1可知，与90 min蛋白消化率对比，秘鲁蒸汽鱼粉120 min蛋白消化率差异不显著（P0.05）；与120 min蛋白消化率对比，180 min蛋白消化率显著提高（P0.05）；与180 min蛋白消化率对比，240 min蛋白消化率显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.020.T001表1不同蛋白原料的体外蛋白消化率时间/min秘鲁蒸汽鱼粉去皮豆粕大豆浓缩蛋白膨化大豆酵母水解物发酵豆粕大豆酶解蛋白3078.53±3.32Eb77.93±0.55Db68.34±0.38Db60.10±0.29Cc82.22±1.29Cb71.07±0.23Dc82.99±0.28Ba6078.93±1.02DEb78.17±1.63Db69.60±1.12CDb61.67±2.32Cd89.31±1.01Ba71.33±0.46Dc92.40±2.01Ba9081.37±1.58CDEb78.97±1.46Dbc69.87±4.47CDd62.40±0.25Cd90.73±1.49Ba71.47±2.75Dd94.90±2.71Aa12082.37±1.16CDc87.50±4.70Cb72.80±1.01BCd62.63±2.58BCe92.21±0.94Aa73.43±0.23CDd95.90±3.24Aa15083.47±2.20Cb91.80±0.17Ba73.09±2.35ABCc66.27±0.67BCd92.70±1.84Aa74.67±1.65Cc95.91±1.28Aa18087.30±3.99Bb92.17±2.08Ba73.93±1.30ABCd67.40±3.83Be92.20±1.74Aa80.53±1.12Bc95.90±1.20Aa21088.60±1.99ABb93.67±0.49ABa74.73±0.94ABd73.87±3.10Ad92.50±1.88Aa81.23±3.30Bc96.01±0.09Aa24091.43±1.20Aa93.83±1.56ABa75.58±0.73Ac74.80±4.42Ac92.01±0.37Aa85.13±1.67Ab96.00±0.10Aa30091.80±0.30Aa95.90±0.66Ab76.41±0.15ABd77.53±1.46Ad92.80±1.54Aa85.33±1.78Ac96.00±0.12Aa36091.47±0.57Ab96.63±1.80Aa77.30±0.91Ad76.83±2.97Ad93.10±0.73Ab85.23±1.63Ac95.92±0.42Aa注：同行数据肩标不同小写字母表示同时间不同原料差异显著（P0.05），同列数据肩标不同大写字母表示同原料不同时间差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%与90 min蛋白消化率对比，去皮豆粕120 min蛋白消化率显著提高（P0.05）；与120 min蛋白消化率对比，150 min蛋白消化率显著提高（P0.05）。与30 min蛋白消化率对比，大豆浓缩蛋白120 min蛋白消化率显著提高（P0.05）；与120 min蛋白消化率对比，消化240 min蛋白消化率显著提高（P0.05）。与180 min蛋白消化率对比，膨化大豆210 min蛋白消化率显著提高（P0.05）。与30 min蛋白消化率对比，酵母水解物60 min蛋白消化率显著提高（P0.05）；与60 min蛋白消化率对比，120 min蛋白消化率显著提高（P0.05）。与30 min消蛋白化率对比，发酵豆粕150 min蛋白消化率显著提高（P0.05）；与150 min蛋白消化率对比，消化180 min蛋白消化率显著提高（P0.05）；与210 min蛋白消化率对比，消化240 min蛋白消化率显著提高（P0.05）。与30 min蛋白消化率对比，大豆酶解蛋白消化60 min蛋白消化率显著增加（P0.05）。2.2不同蛋白原料分子量占蛋白比（见表2）由表2可知，秘鲁蒸汽鱼粉2~6肽占比为1.10%；酵母水解物2~6肽占比为41.88%；发酵豆粕2~6肽占比为3.21%；大豆酶解蛋白2~6肽占比为47.24%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.020.T002表2不同蛋白原料分子量占蛋白比原料10 000 Da10 000~3 000 Da3 000~1 000 Da150~1 000 Da150 Da粗蛋白秘鲁蒸汽鱼粉86.40±0.200.82±0.021.61±0.181.10±0.0410.10±2.0466.41±0.03酵母水解物3.01±0.400.92±0.5118.00±1.5141.88±2.0335.22±1.4551.92±0.05发酵豆粕93.32±2.250.64±0.031.73±0.293.21±0.101.25±0.2352.41±0.03大豆酶解蛋白37.01±0.2310.13±0.1015.01±0.0632.23±1.935.62±1.4556.45±0.04%2.3不同蛋白原料的总抗氧化能力（见表3）由表3可知，与秘鲁蒸汽鱼粉、发酵豆粕相比，酵母水解物、大豆酶解蛋白总抗氧化能力显著升高（P0.05），酵母水解物与大豆酶解蛋白差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.020.T003表3不同蛋白原料总抗氧化能力项目秘鲁蒸汽鱼粉酵母水解物发酵豆粕大豆酶解蛋白总抗氧化能力1.54±1.50b40.29±3.30a4.60±1.73b28.98±1.07a注：同行数据肩标不同字母差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。mmol/g2.4不同蛋白原料的持钙能力（见图1）由图1可知，秘鲁蒸汽鱼粉、发酵豆粕、大豆酶解蛋白加入模拟反应体系后，磷酸钙沉淀开始生成的时间为5~10 min，酵母水解物生成磷酸钙沉淀时间则为15~20 min。试验过程中所需NaOH消耗量从大到小依次为：秘鲁蒸汽鱼粉发酵豆粕大豆酶解蛋白酵母水解物。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.020.F001图1不同蛋白原料的持钙能力3讨论3.1不同蛋白原料蛋白消化速率的差异分析蛋白原料的空间结构影响消化速率[15]。研究表明，蛋白质四级结构的疏水作用、静电作用、氢键作用增强，三级结构中二硫键发生交联，导致体外蛋白消化率降低[16]；二级结构α螺旋含量与蛋白消化率呈正相关关系，β折叠含量与蛋白消化率呈负相关关系[17-18]。本研究显示，秘鲁蒸汽鱼粉主要以肌原纤维蛋白、肌浆蛋白为主[19]，蛋白质三、四级结构致密度低。因此，在120、180、240 min时蛋白消化速率显著提高，说明秘鲁蒸汽鱼粉在120 min后消化速率增快。豆粕以球蛋白为主，蛋白质三、四级结构紧密、二级结构中β-折叠含量高[20]，在30~90 min蛋白消化速率缓慢，90 min蛋白消化率显著提高，360 min消化率高达96%，说明豆粕的可消化性高。实际生产中，大豆类原料通过物理（加热、高压）、化学（醇洗）、生物（发酵、酶解）等工艺处理改变蛋白质结构。蛋白原料在60~85 ℃温度下，蛋白质二级结构改变，随着温度升高α-螺旋含量增加、β-折叠含量下降，体外消化率显著增加[21]；当温度超过85 ℃将导致蛋白质过度变性，二硫键再次发生交联，使α-螺旋含量下降、β-折叠含量增加，体外蛋白消化率降低[20]。蛋白原料在150~200 MPa高压下，蛋白质三、四级结构改变，蛋白质分子间氢键断裂、疏水作用减弱，引起蛋白质解聚从而提高体外蛋白消化率；当压力超过200 MPa蛋白质发生聚集反应，体外蛋白消化率降低[22]。膨化大豆主要采用高温高压工艺处理，蛋白消化速率在180、210 min显著提升，且在360 min蛋白体外消化率仅77%，说明膨化大豆消化速率慢、可消化性低。蛋白原料在25 ℃以上醇洗浸出时蛋白质四级结构改变，较强次级键和共价键含量增加、蛋白质结构展开暴露出疏水基，疏水作用增强，使蛋白消化率降低[23]。大豆浓缩蛋白主要采用醇洗工艺处理，蛋白消化速率在120、210、360 min时消化速率显著提升，且360 min消化率仅76%，说明大豆浓缩蛋白消化速率慢、可消化性低。发酵通过微生物代谢产生的胞外酶对蛋白质结构进行改性或修饰，但实际生产中豆粕发酵后需要干燥脱水，干燥温度直接影响蛋白消化率[24]。发酵豆粕检测结果显示，在150 min蛋白消化率显著提高，360 min蛋白消化率仅为85%。深度液态酶解可以打开蛋白质三、四级空间结构，暴露酶切位点、水解肽键，将长肽链变成2~6肽，提高蛋白质消化率及消化速率[25]。大豆酶解蛋白主要通过深度液态酶解工艺处理，其60 min蛋白消化速率显著提升，且消化率高达92%，在360 min的蛋白消化率高达95.92%，说明大豆酶解蛋白消化速率快、可消化性高。不同来源、不同工艺处理的蛋白原料，空间结构不同，导致蛋白质消化率及消化速率的差异。实际生产中，仔猪饲料的能量来源采取快、中、慢消化速率的原料搭配组合。大米在动物体内0.5 h消化释放葡萄糖，1.5 h血液葡萄糖达到峰值；小麦在动物体内2 h消化释放葡萄糖，2.5 h血液葡萄糖达到峰值；玉米在动物体内2~16 h持续消化释放葡萄糖，较长时间维持血液葡萄糖浓度[6-7]。本研究中，大豆酶解蛋白主要在1~2 h快速消化释放氨基酸；秘鲁蒸汽鱼粉、去皮豆粕主要在3~4 h消化释放氨基酸；大豆浓缩蛋白、膨化大豆、发酵豆粕主要在5~6 h消化释放氨基酸。为保证饲料能量和蛋白消化、吸收的同步性，提高饲料转化效率，建议设计仔猪料时，蛋白原料采用大豆酶解蛋白/酵母水解物+鱼粉/豆粕+大豆浓缩蛋白/膨化大豆/发酵豆粕组合，与能量原料大米+小麦+玉米进行匹配。3.2不同蛋白原料2~6肽含量的差异分析蛋白原料中2~6肽（150~1 000 Da）可被乳仔猪肠道细胞直接吸收，促进肠道的生长发育，提高仔猪消化吸收能力，加快生长速度。2~4肽主要通过PepT1通道吸收进入肠道上皮细胞，加速小肠功能发育[26]；4~6肽主要通过细胞间隙吸收进入血液循环，直接参与体蛋白合成，提高蛋白利用率。研究表明，蛋白原料的结构决定功能，通过不同工艺处理改变蛋白质的结构可产生相对分子质量150~1 000 Da的肽[27]。本研究4种蛋白原料蛋白分子量区间占比在150~1 000 Da，大豆酶解蛋白酵母水解发酵豆粕秘鲁蒸汽鱼粉。大豆酶解蛋白、酵母水解物通过酶解深加工处理，将大分子蛋白降解为相对分子质量150~1 000 Da的肽，具有生物活性功能[28-29]。通过发酵工艺处理的蛋白原料，蛋白相对分子质量主要集中在10 000 Da以上，仅有少量大分子蛋白降解为相对分子质量150~1 000 Da肽；鱼粉没有进行深加工处理，150~1 000 Da肽含量仅1.1%。实际生产中使用3%酵母水解物、2%~4%大豆酶解蛋白、1%~2%小麦水解蛋白均可降低乳仔猪腹泻率，增加肠绒毛长度，降低肠道隐窝深度，提高肠道紧密连接蛋白表达量，提高饲料转化效率，降低乳仔猪料重比[30-31]。因此，150~1 000 Da肽含量高的蛋白原料可促进肠道发育，提高饲料转化效率，提高仔猪生长性能。3.3不同蛋白原料抗氧化能力的差异分析蛋白原料中的抗氧化活性成分发挥抗氧化功能，通过清除动物体内氧化产物维持氧化与抗氧化之间的动态平衡，促进动物体内组织如肠道的损伤修复以及维持机体健康。研究表明，由组氨酸、酪氨酸、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酸等氨基酸组成的小分子肽具有抗氧化能力[32-33]。本研究4种蛋白原料的总抗氧化能力强至弱依次为：酵母水解物大豆酶解蛋白发酵豆粕秘鲁蒸汽鱼粉。酵母水解物水解后产生大量游离氨基酸、核苷酸等物质，作为内源性自由基清除剂和抗氧化剂，协同发挥抗氧化作用[34]。大豆酶解蛋白通过酶解产生Glu-Tyr、Ala-Phe、Arg-Pro-Leu-Lys-Pro-Trp等抗氧化活性肽，增强乳仔猪体内抗氧化酶活性和抗氧化物质含量，从而清除体内过多的氧化产物，维持机体和肠道健康[35]；鱼粉和发酵豆粕中肽含量低，抗氧化能力显著低于其他2种蛋白原料。实际生产中使用3%酵母水解物可降低乳仔猪血清中丙二醛含量，提高总抗氧化能力和谷胱甘肽过氧化物酶活性[36]；使用1.5%~2.5%大豆酶解蛋白可提高乳仔猪血液中过氧化氢酶、超氧化歧化酶、谷胱甘肽还原酶活性，降低肝脏中丙二醛含量，提高谷胱甘肽转移酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性。因此，使用具有抗氧化功能的蛋白原料可提高乳仔猪机体总抗氧化能力，改善肠道健康。3.4不同蛋白原料持钙能力的差异分析蛋白原料中特定氨基酸组成的小分子肽具有螯合矿物质的能力。研究表明，由甘氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸等组成的小分子肽与阴离子的金属盐类矿物质形成螯合物，提高矿物质含量，进而达到动物肠道有效吸收部位的有限浓度；或通过肽或氨基酸吸收通道，促进动物对矿物质利用[37]。本研究4种蛋白原料持钙能力强至弱依次为：酵母水解物大豆酶解蛋白发酵豆粕秘鲁蒸汽鱼粉。酵母水解物、大豆酶解蛋白通过酶解深加工处理的小分子肽含量均高于发酵豆粕、秘鲁蒸汽鱼粉，表现较强持钙能力。实际生产中使用1.5%~2.0%大豆酶解蛋白提高仔猪对钙的表观消化率。动物摄入钙主要通过小肠吸收，因此，使用具有强持钙能力的蛋白原料可提高仔猪肠道对矿物质的吸收利用，促进动物的生长发育。4结论本研究表明，不同蛋白原料消化速率不同，大豆酶解蛋白主要在1~2 h消化，鱼粉、去皮豆粕主要在3~4 h消化，大豆浓缩蛋白、膨化大豆、发酵豆粕主要在5~6 h消化。大豆酶解蛋白、酵母水解物具有小分子肽含量高、抗氧化能力强、持钙能力强的功能性，实际生产中具有更高的应用价值。