紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种富含蛋白质、多种微生物和矿物质的优质饲用牧草。苜蓿制成青贮饲料可以延长储存时间，提升饲料适口性和消化率[1]。发酵过程中添加青贮添加剂可以提升青贮发酵品质和减少营养物质损失[2-4]。目前青贮添加剂可大致分为发酵促进型添加剂和发酵抑制型添加剂。发酵促进型添加剂通过促进发酵环境中乳酸菌快速繁殖，降低环境pH值，抑制好氧微生物活力和不良微生物的生长[5-7]，达到改善发酵品质和营养价值的目的[8-11]，如酶制剂、乳酸菌、绿汁发酵液和糖类等。发酵抑制型添加剂包括有机酸（苯甲酸、甲酸、乙酸及丙酸等）和无机酸（盐酸、磷酸及亚硝酸钠等）两类。本试验以紫花苜蓿为研究对象，旨在探讨不同种类的青贮添加剂（乳酸菌、苯甲酸钠、纤维素酶）对紫花苜蓿青贮的影响，为紫花苜蓿青贮添加剂的合理选择和使用提供参考。1材料与方法1.1试验材料紫花苜蓿购自滨州禾跃牧草有限公司。开花初期刈割，株高为80~100 cm，其营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.021.T001表1青贮前紫花苜蓿营养水平项目平均值标准偏差干物质/(g/kg FW)243.867.45粗蛋白/(g/kg DM)206.540.81中性洗涤纤维/(g/kg DM)344.589.84酸性洗涤纤维/(g/kg DM)235.246.81水溶性碳水化合物/(g/kg DM)68.583.48乳酸菌/(lgCFU/g FW)7.180.08好氧性细菌/(lgCFU/g FW)6.820.22酵母/(lgCFU/g FW)3.150.58注：FW为鲜重；DM为干物质。试验所用乳酸菌制剂购自科拓生物技术股份有限公司，乳酸菌含量为5×1010 CFU/g，成分包括布氏乳杆菌、植物乳杆菌以及乳酸片球菌；苯甲酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶（β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）购自诺维信（中国）生物技术有限公司（Cellic CTec2产品）；聚乙烯单向呼吸阀厌氧袋（22 cm×40 cm）购自本地商铺。1.2试验设计将紫花苜蓿晾晒至含水量约为65%，粉碎机切短至1~2 cm，混合均匀备用。试验设置4个组，即对照组、乳酸菌组、苯甲酸钠组、纤维素酶组。对4组试验材料分别做如下处理（以鲜重质量为基础）：不添加任何青贮添加剂、添加10 mg/kg的乳酸菌制剂、添加2 g/kg的苯甲酸钠以及添加50 mg/kg的纤维素酶。切短后的苜蓿与添加剂、蒸馏水等混匀，称取约1 kg样品置于聚乙烯厌氧袋抽真空，每组设置3个重复，共计12袋。室温（22~29 ℃）避光发酵60 d。1.3测定指标及方法1.3.1营养价值、发酵品质和感官评定指标紫花苜蓿在青贮前和后采用四分法，分别取约300 g样品。样品65 ℃烘干48 h，粉碎至1 mm左右晾晒。干物质、粗蛋白和粗脂肪含量参照国际标准进行测定[12]。采用尼龙袋法测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维[13]，纤维分析仪分析测定。钙含量的测定采用高锰酸钾法测定。磷含量的测定参照GB/T 6437—2018标准，采用分光光度法测定[14]。另取3个样品重复（20 g）检测发酵指标，使用便携式pH计测定pH值。15 g样品10 000×g离心15 min，取上清液分装于5 mL离心管，-20 ℃保存。液相色谱仪（天瑞LC310型）测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等物质的含量。采用气相色谱仪（GC-9802）测定总挥发性脂肪酸含量[15]。在气味、结构、色泽等方面评价添加不同添加剂的青贮饲料，采用德国农业协会（DLG e.V.）的饲料评价方法，青贮饲料感官评定见表2。总得分分为：1级（20~16分）、2级（15~10分）、3级（9~5分）、4级（4~0分）。评价由专人负责。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.021.T002表2青贮饲料感官评定评分标准分数气味带有明显的面包香味或芳香果味，无丁酸臭味14微弱的丁酸臭味，芳香味弱，或带有较强的酸味10丁酸味较重，或有刺鼻的焦煳霉味或臭味4带有很强的丁酸臭味或氦味，或几乎无酸味2茎叶结构保持良好4叶子结构保持较差2带有轻度霉菌或轻度污染，或茎叶结构保持极差1茎叶带有腐烂或污染严重0与原料相似，烘干后呈淡褐色2色泽稍有变色，带褐色或呈淡黄色1变色严重，墨绿色或褪色成黄色，带有较强的霉味01.3.2瘤胃降解率指标选择体重（450±50）kg、装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛6头。将不同添加剂处理的紫花苜蓿青贮添加到日粮中进行试验。试验日粮配比：玉米26.8%、麸皮10.3%、豆粕13.5%、羊草20.3%、紫花苜蓿青贮26.4%、预混料2.7%。分别于每日9：00和21：00饲喂，自由饮水。取瘤胃发酵液样品，便携式pH计立即测定pH值。采用尼龙袋法对紫花苜蓿青贮饲料的瘤胃降解率进行测定[13]，分别检测24 h和48 h的干物质和中性洗涤纤维在瘤胃内的含量。尼龙袋规格10 cm×5 cm，孔径50 μm，每个样品、每个时间点、每头牛设置3个重复，称量2.5 g左右青贮样品装入尼龙袋冲洗，65 ℃烘干至恒重后粉碎，计算降解率。干物质降解率=(消化前样品干物质含量-消化后样品干物质含量)/消化前样品干物质含量(1)中性洗涤纤维降解率=(消化前样品中性洗涤纤维含量-消化后样品中性洗涤纤维含量)/消化前样品中性洗涤纤维含量(2)1.4数据统计与分析数据采用Excel 2016汇总整理，SPSS 27.0软件的GLM模型方法分析。结果以平均值表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮营养成分的影响（见表3）由表3可知，乳酸菌处理组苜蓿青贮的粗蛋白含量显著高于其他组（P0.05）。苯甲酸钠组和纤维素酶组苜蓿青贮的中性洗涤纤维含量显著低于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.021.T003表3不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮营养成分的影响项目干物质粗蛋白中性洗涤纤维酸性洗涤纤维粗脂肪钙磷对照组29.9120.45b35.53a35.114.100.470.35乳酸菌组31.4822.25a37.64a37.024.070.470.38苯甲酸钠组31.0619.06c33.34b34.414.360.440.37纤维素酶组30.2220.93b32.57b36.824.140.480.38SEM0.150.070.220.160.080.010.01P值0.4320.0010.0020.3380.1600.9190.986注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.2不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮发酵品质及感官评价得分的影响（见表4、表5）由表4可知，不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮的乙酸和丁酸含量影响不显著（P0.05）；各试验组的pH值均显著低于对照组（P0.05）；与对照组相比，各试验组的乳酸含量均显著升高（P0.05）；苯甲酸钠组的丙酸含量显著高于其他组（P0.05）；乳酸菌组的总挥发性脂肪酸显著高于对照组（P0.05），苯甲酸钠组和纤维素酶组的总挥发性脂肪酸均显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.021.T004表4不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮发酵品质的影响项目pH值乳酸/(mmol/L)乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)丁酸/(mmol/L)总挥发性脂肪酸/(mmol/L)对照组3.59a50.31c11.740.08b0.0154.78b乳酸菌组3.40b70.66a13.330.13b0.0258.88a苯甲酸钠组3.42b65.79b12.830.15a0.0150.68d纤维素酶组3.48ab64.41b14.050.11b0.0153.08cSEM0.011.190.750.090.010.91P值0.0380.0030.7660.0010.1830.001由表5可知，试验组得分均高于对照组，乳酸菌组总分最高，清新的果香气，外观良好，结构致密均匀，呈优质青贮的淡褐色，评定为1级。苯甲酸钠组在结构和色泽方面略逊于乳酸菌组，但总分仍为1级优良。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.021.T005表5不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮感官评价指标的影响组别气味结构色泽总分等级对照组821112乳酸菌组1342191苯甲酸钠组1222161纤维素酶组11301422.3不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮瘤胃降解率的影响（见表6）由表6可知，苯甲酸钠组苜蓿青贮24 h干物质降解率显著高于对照组（P0.05）；纤维素酶组苜蓿青贮24 h干物质降解率、24 h中性洗涤纤维降解率和48 h干物质降解率显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.021.T006表6不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮瘤胃降解率的影响项目pH值24 h干物质降解率/%48 h干物质降解率/%24 h中性洗涤纤维降解率/%48 h中性洗涤纤维降解率/%对照组6.6565.59c70.97b30.36b44.69乳酸菌组6.6666.27abc71.13b31.15ab44.94苯甲酸钠组6.5766.92ab71.11b31.47ab45.10纤维素酶组6.6367.34ab73.61a31.78a45.32SEM0.010.110.280.180.09P值0.0890.0350.0260.0830.6283讨论3.1不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮营养品质的影响本研究结果显示，乳酸菌组和对照组的营养成分较为接近，多项指标差异均不显著（粗蛋白除外），与李金俐等[10]的研究结果一致。王丽学等[9]研究表明，植物乳杆菌显著提高粗蛋白质含量，提高乳酸和粗脂肪的含量，显著降低酸性洗涤不溶蛋白、中性洗涤不溶蛋白以及酸性洗涤纤维含量。结果分歧可能是不同研究选择的乳酸菌添加剂的菌种种类、混合比例、活菌数等存在差异，导致青贮效果不同，提示进行青贮前应根据添加剂属性、环境因素等筛选适宜添加量。苯甲酸钠组和纤维素酶组的中性洗涤纤维含量较对照组显著降低，与薛艳林等[16]和薛春胜等[17]的研究结果一致，原因可能是苯甲酸钠和纤维素酶均对降解植物细胞的细胞壁，尤其纤维素酶降解为单糖，将纤维素转换为发酵底物[18]。苯甲酸钠可直接酸化发酵环境，抑制青贮环境的有害微生物活动，抑制植物自身呼吸作用，减少营养物质的自身损耗，较好地保留牧草原有的营养价值[19-20]。3.2不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮发酵品质的影响优质青贮饲料的pH值和乳酸含量应具有以下特征：pH值小于4.2[21]，乳酸含量为4%~6%[22]。本研究中各组的各项指标均已达到上述优质青贮饲料标准。本研究结果表明，不同添加剂（乳酸菌、苯甲酸钠、纤维素酶）对紫花苜蓿青贮均可提升青贮发酵品质，提升乳酸含量，降低青贮pH值；乳酸菌组青贮发酵品质表现最好，可能与添加剂影响青贮的作用机理不同相关。乳酸菌添加剂直接作用于发酵环境中的乳酸菌群，提升发酵初期的数量，使乳酸菌得以迅速增殖，快速产生大量的乳酸。苯甲酸钠可直接酸化青贮饲料，改善发酵品质，对乳酸菌活动造成影响。纤维素酶从植物纤维素层面影响青贮品质，降解细胞壁和各种纤维素，水解为单糖增加发酵底物，改变饲料中的纤维素结构，降低纤维含量，提高动物对青贮饲料的采食量和消化率[23]。通过感官评定，添加乳酸菌的紫花苜蓿青贮效果最佳。钟书等[24]研究表明，与添加乳酸菌和纤维素酶相比，添加二者的复合型添加剂（添加乳酸菌+纤维素酶）对苜蓿青贮品质具有更显著的提高效果。陈雷等[25]研究发现，与单宁酸组相比，“单宁酸+乳酸菌”复合组能够减轻单宁酸组对青贮饲料干物质降解的抑制作用；复合使用青贮添加剂是更优的选择，但选择复合添加种类、含量、比例等均需进一步研究。3.3添加剂对紫花苜蓿青贮瘤胃降解率的影响反刍动物胃肠道饲料营养物质的消化和吸收效率，受饲料中干物质和中性洗涤纤维降解率的影响[26]。本研究中，苯甲酸钠组和纤维素酶组的24 h干物质降解率相较于对照组显著提高，纤维素酶组降解率最高。不同添加剂对青贮的瘤胃降解率均存在一定程度的影响，但目前的结论仍存在一定分歧。研究表明，乳酸菌添加剂可以更好地提高玉米秸秆、棉花秸秆和全株玉米青贮的中性洗涤纤维降解率[26-28]。纤维素酶对提高瘤胃降解率具有一定的促进作用。王亚芳等[29]和万江春等[29]对玉米秸秆青贮的研究显示，添加纤维素酶的中性洗涤纤维降解率相较于对照组得到提升，与本试验结果一致。推测纤维素酶能够提高瘤胃降解率的主要原因是能够将牧草中的纤维素等水解，降低饲料中总纤维含量，改变青贮中纤维素的总体结构，水解后的单糖等营养物质更易被瘤胃吸收，在瘤胃中继续水解剩余的纤维素，进一步提高纤维降解率。因此，青贮中添加纤维素酶是一种较为有效的提升青贮饲料营养物质消化率的途径。4结论乳酸菌、苯甲酸钠、纤维素酶对紫花苜蓿青贮的营养价值、发酵品质和瘤胃降解率均有不同程度提升作用。综合评价来看，各组紫花苜蓿青贮总体饲喂价值由高到低依次为：乳酸菌组纤维素酶组苯甲酸钠组对照组。