我国年产白酒糟约3 800万t[1]，传统处置方式导致土壤污染、土质退化和有害气体排放等环境问题[2]。将白酒糟干燥后饲喂反刍动物可以提高白酒糟的利用率，但白酒糟适口性差且含有多种抗营养因子导致添加量受限[3-5]。研究表明，微生物发酵酒糟对反刍动物的促生长效果明显优于干酒糟[6-8]。固态发酵（SSF）是一种将微生物菌种培养在固体基质上，且不需要额外添加游离水的发酵过程[9]，发酵环境相对易控制，已应用于生产生物饲料产品[10]。近年来，固态发酵白酒糟技术已成为研究热点。酿酒酵母常作为发酵菌剂、霉菌毒素吸附剂等使用，以提升原料饲用价值。产朊假丝酵母是生产单细胞蛋白饲料的优良菌种[11]。芽孢杆菌能够高效利用饲料原料中的营养物质，分泌多种蛋白及代谢产物并将结构性化合物转变为可溶性糖[12-13]。黑曲霉、米曲霉通过产生纤维素酶及相关酶类降解饲料原料中的纤维素提高蛋白、脂肪等养分含量[14-15]。酵母菌与其他有益菌组合后对白酒糟进行固态发酵可起互补作用[16-18]，但不同菌种组合的发酵效果缺乏比较。酵母发酵酒糟的质量受菌种剂量、发酵温度、发酵时间和底物含水量等多因素影响。因此，酵母高效发酵菌种配方的筛选以及发酵工艺的优化对提高白酒糟在反刍动物上的应用具有实际意义。本试验以酵母菌为主，设计8个不同菌种组合方式，将酱香型白酒糟作为发酵原料，相同条件下进行固态发酵，通过对比不同组合的发酵效果筛选出最佳菌种配方；以真蛋白作为前期试验主要考核指标，对固态发酵白酒糟的生产工艺进行优化；后期在标准生产车间进行固态发酵放大试验，通过检测发酵白酒糟营养水平和霉菌毒素含量明确饲用价值。使用酱香型发酵酒糟（MFFDG）饲喂断奶羔羊，分析发酵酒糟对羔羊生长性能的影响。1材料与方法1.1菌种和发酵底物酿酒酵母（2×1010 CFU/g）、枯草芽孢杆菌（1×1011 CFU/g）、地衣芽孢杆菌（1×1011 CFU/g）和黑曲霉（3×109 CFU/g）均购自山东蔚蓝生物有限公司；产朊假丝酵母（8×109 CFU/g）购自云南力莲生物有限公司；米曲霉（5×109 CFU/g）购自山东济宁玉园生物有限公司。微生物菌种保存温度均为5 ℃以下，酵母菌活化时添加少量糖蜜（占酒糟质量的0.5%）和温水（糖蜜质量的8~10倍）进行快速扩繁。新鲜的酱香型白酒糟由路德生物环保技术（古蔺）有限公司负责提供，每次试验选用的酒糟保证来自相同酒厂同批次产生的酒糟，固态发酵放大生产阶段所用300 t酒糟及前期试验所用酒糟均购自茅台镇同一酿酒厂。1.2试验设计试验选用6种安全的微生物菌种，设计8个组合，固态发酵酱香型白酒糟不同菌种组合设计见表1。温度为32 ℃、酒糟底物含水量为45%条件下，与酱香型白酒糟混合进行固态发酵，通过固态发酵前后营养物质含量变化，筛选最适宜生产的菌种组合。该部分试验于2020年在四川古蔺路德生物环保技术有限公司实验室完成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.015.T001表1固态发酵酱香型白酒糟不同菌种组合设计组别酿酒酵母枯草芽孢杆菌黑曲霉米曲霉地衣芽孢杆菌产朊假丝酵母A组0.100.050.050.0500B组00.050.050.0500.25C组0.1000.050.050.050D组000.050.050.050.25E组0.100.050.050.0500.20F组0.100.050.050.050.050.25G组0.1000.050.0500H组0.1000000注：表中以100 g酒糟底物为基础计算每种菌种添加量（如0.10%酿酒酵母的添加量为0.1 g）。%以含水量、培养温度、发酵时间3个水平进行正交设计，以真蛋白产量作为唯一参考指标确定最优工艺参数。条件优化试验于2020年在西南大学动物科学技术学院实验室进行。正交试验设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.015.T002表2正交试验设计水平A含水量/%B培养温度/℃C发酵时间/d140323250354355385固态发酵规模验证试验在路德生物环保技术（古蔺）有限公司生产车间进行，使用300 t初始水分约为55%的预烘干酒糟原料在发酵园发酵4 d。确保菌种能够正常生长繁殖，发酵前期对发酵园中的酒糟翻料（1次/3 h），保证氧气持续供应，期间每12 h对发酵园酒糟进行取样测定酵母菌数量，直到其达到4×109 CFU/g后停止翻料，进入厌氧代谢阶段。待发酵结束后，对发酵酒糟进行低温干燥，确保酵母数量超过1×108 CFU/g，进行流水线粉碎，检测发酵酒糟成品中的营养成分和毒素含量。固态发酵酱香白酒糟车间生产工艺见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.015.F001图1固态发酵酱香白酒糟车间生产工艺1.3饲喂试验饲喂试验在腾达牧业有限公司进行，将27头体重、日龄相近的断奶母羔羊随机分为3组，每组3个重复，每个重复3只羊。对照组羊饲喂基础日粮，基础日粮购自邳州市小河科技发展有限公司（羊管家903），商品全价颗粒料营养水平见表3。试验Ⅰ组羊饲喂基础日粮+50 g/d MFFDG；试验Ⅱ组羊饲喂基础日粮+150 g/d MFFDG。试验期13 w，预试期1 w。分别在正式试验期后第6 w和第12 w的最后1 d，晨饲前对断奶羔羊进行称重，每日统计日粮的投料量和剩余量，计算平均日采食量和料重比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.015.T003表3商品全价颗粒料营养水平（干物质基础）营养水平含量总能/(MJ/kg)17.25粗蛋白/%16.63粗脂肪/%2.04粗灰分/%10.31中性洗涤纤维/%37.91酸性洗涤纤维/%24.80钙/%1.08磷/%0.64注：营养水平均为实测值。1.4测定指标及方法所有样品研磨机粉碎，水分含量参照GB/T 6435—2014测定；粗脂肪采用GB/T 6433—2006测定；粗蛋白参照GB/T 6432—2018测定；真蛋白检测将蛋白质沉淀，除去非蛋白氮，用凯氏定氮法测定；粗灰分采用GB/T 6438—2007测定；计算有机物含量；中性洗涤纤维含量参照GB/T 6434—2006测定；钙和磷含量依据GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018测定；霉菌毒素含量采用酶联免疫吸附测定试验（ELISA）试剂盒检测。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2016进行统计整理，SAS 9.4软件中进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同菌种组合发酵前后酒糟中的营养物质含量变化（见表4）由表4可知，各菌种组合发酵后白酒糟中的真蛋白含量显著高于发酵前白酒糟中的真蛋白含量（P0.05），提升效果最好的是E组、G组和F组，E组真蛋白含量显著高于F组（P0.05）。A组、C组和E组粗脂肪含量比发酵前显著提升（P0.05），E组显著高于其他发酵组（P0.05）。A组中性洗涤纤维含量比发酵前显著降低（P0.05），除D组、F组外的其他各组在发酵后中性洗涤纤维含量均显著高于发酵前（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.015.T004表4不同菌种组合发酵前后酒糟中的营养物质含量变化（干物质基础）组别真蛋白粗脂肪中性洗涤纤维有机物发酵前16.38±0.10f7.70±0.13cd44.80±0.36e91.04±0.09abA组17.87±0.08de8.59±0.40b41.90±0.17f91.09±0.12abB组17.74±0.07e8.23±0.19bc47.94±0.41c91.22±0.09abC组18.12±0.18d8.82±0.21b50.87±0.51a91.21±0.04abD组18.53±0.26c7.02±0.42e44.13±0.37e91.09±0.14abE组19.15±0.18a9.83±0.10a46.86±0.45d91.14±0.15abF组18.83±0.11b8.25±0.43bc48.13±0.45c91.00±0.24bG组18.89±0.20ab7.89±0.58cd46.40±0.89d91.13±0.11abH组18.08±0.18d7.46±0.26de49.26±0.35b91.33±0.29a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.2固态发酵工艺正交试验中真蛋白的极差分析（见表5）由表5可知，发酵条件的最佳组合为A3B3C3，即酒糟底物含水量55%、温度38 ℃、发酵5 d。3因素对真蛋白产量的影响为：发酵时间温度含水量。对此发酵条件进行验证试验，结果发现A3B3C3组合下真蛋白含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.015.T005表5固态发酵工艺正交试验中真蛋白的极差分析项目ABC真蛋白/%111118.10±0.14f222118.39±0.35f333118.73±0.15e413219.85±0.22abc521219.16±0.08d632219.53±0.17c712319.80±0.13bc823319.96±0.12ab931320.14±0.12ak119.2519.1318.41k219.1719.2419.51k319.4719.5119.97R0.220.381.56主次关系CBA最佳组合A3B3C32.3生产车间固态发酵前后酱香型白酒糟中营养成分的变化（见表6）由表6可知，使用前期筛选的菌种组合和条件，在车间进行固态发酵放大生产，酱香型白酒糟的粗蛋白、真蛋白以及钙含量比发酵前显著提高（P0.05），有机物和粗纤维含量较发酵前显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.015.T006表6生产车间固态发酵前后酱香型白酒糟中营养成分的变化（干物质基础）组别有机物粗蛋白真蛋白粗脂肪粗纤维钙磷发酵前90.84±0.07b29.49±0.54b19.74±0.22b10.11±0.1119.62±0.19a0.45±0.01b0.48±0.01发酵后90.39±0.04a30.90±0.34a22.98±0.21a10.18±0.1217.60±0.44b0.51±0.01a0.50±0.01%2.4固态发酵前后酱香型白酒糟中毒素含量的变化（见表7）由表7可知，生产车间固态发酵后酱香型白酒糟中黄曲霉毒素的含量差异不显著（P0.05），呕吐素含量较发酵前显著提升（P0.05），二者均低于国家对饲料中毒素的限制水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.015.T007表7固态发酵前后酱香型白酒糟中毒素含量的变化组别黄曲霉毒素B1呕吐毒素发酵前3.65±0.1036.31±4.61b发酵后3.61±0.32109.20±6.12a国家标准限制量10.001 000.00μg/kg2.5饲喂MFFDG对断奶羔羊生长性能的影响（见表8）由表8可知，正式试验期后7~12 w，试验Ⅰ组、Ⅱ组羔羊的平均日增重显著高对照组（P0.05），试验Ⅰ组、Ⅱ组羔羊的料重比显著低于对照组（P0.05）。正式试验期后1~12 w，试验Ⅰ组羔羊的平均日增重显著高于对照组（P0.05），试验Ⅰ组羔羊的料重比显著低于对照组（P0.05）；添加发酵酒糟对断奶羔羊的平均日采食量无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.015.T008表8饲喂MFFDG对断奶羔羊生长性能的影响项目基础日粮组试验Ⅰ组试验Ⅱ组初重/kg9.60±0.929.49±0.529.83±0.74第6 w体重/kg14.14±1.4314.32±0.8213.86±1.14第12 w体重/kg17.56±1.3018.76±1.3918.00±1.71正式试验期后1~6 w平均日增重/[g/(只·d)]114.14±15.53114.95±23.7195.87±19.70平均日采食量/[g/(只·d)]789.55±94.93773.41±99.59782.24±112.79料重比7.04±1.037.03±1.718.49±1.74正式试验期后7~12 w平均日增重/[g/(只·d)]81.48±15.88b100.00±15.61a98.54±19.34a平均日采食量/[g/(只·d)]858.27±29.27851.04±32.42848.36±29.46料重比10.88±2.06a8.69±1.32b8.92±1.81b正式试验期后1~12 w平均日增重/[g/(只·d)]94.83±9.82b110.32±17.05a97.21±14.74ab平均日采食量/[g/(只·d)]827.62±74.85816.42±80.20819.56±84.24料重比8.81±0.87a7.56±1.20b8.62±1.40ab注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。3讨论3.1固态发酵白酒糟最佳菌种组合筛选微生物菌种在使用固态发酵提升底物活性物质含量的过程中发挥关键作用。与单一菌种相比，多菌种组合可有效利用发酵底物的营养成分，提高固态发酵的效率[17,19-20]，具体菌种组合的选择应视发酵底物而定。Yao等[21]研究表明，产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌组合可显著提升酒糟中的蛋白质、粗脂肪和中性洗涤纤维含量。范恩帝等[22]使用酿酒酵母、产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、康宁木霉、黑曲霉和嗜热毁丝霉混菌组合发酵白酒糟，蛋白质含量较发酵前显著提升。本研究表明，各混菌组合均可显著提升酱香型白酒糟中的蛋白含量，与上述报道一致，提升效果最好的是酿酒酵母、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉混菌组合，其次是酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉混菌组合；不同菌种组合间对粗脂肪和中性洗涤纤维的发酵效果略有差异，D组（0.25%产朊假丝酵母+0.05%地衣芽孢杆菌+0.05%黑曲霉+0.05%米曲霉）粗脂肪含量较发酵前显著降低，B组（0.25%产朊假丝酵母+0.05%枯草芽孢杆菌+0.05%黑曲霉+0.05%米曲霉）中性洗涤纤维含量较发酵前显著降低，与Yao等[21]的研究不一致，可能因为芽孢杆菌需要与霉菌混合才可充分发挥对酒糟中的粗脂肪和中性洗涤纤维的降解作用。张玉诚等[18]研究发现，利用枯草芽孢杆菌、米曲霉、白地霉和绿色木霉混菌发酵白酒糟时，粗脂肪和中性洗涤纤维含量较发酵前显著降低，与本研究结果相似。不同菌种对碳源的利用程度存在一定差异，且不同微生物的适宜环境条件不同，导致发酵效果不一致。各菌种组合均能够提升白酒糟的真蛋白含量，但考虑生产成本，将酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉确定为后期研究的适宜菌种组合。3.2白酒糟固态发酵条件的优化固态发酵工艺参数优化可稳定提升生产效率。发酵温度、底物含水量、发酵时间等影响SSF生产的主要因素。底物含水量过低，降低营养物质的溶解度，限制微生物的生长[21]；底物水分过高，导致基质间隙率下降，导致原料黏附，影响氧气流通[23]。温度过高导致某些蛋白质和酶变性，适度升温可以促进微生物分泌相关的酶[24-25]。发酵时间长短直接影响代谢产物的积累和底物的消耗，时间过短导致发酵不充分；发酵时间过长使原料被浪费[26]。Yao等[21]使用产朊假丝酵母与枯草芽孢杆菌对黄酒糟进行固态发酵，粗蛋白质产量最佳的条件为：底物含水量50%、温度30 °C、菌种比例2∶1。于海曼[16]使用枯草芽孢杆菌发酵白酒糟的最优条件为物料含水量60%、接种量20%、发酵5 d。Shi等[27]研究发现，产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黑曲霉组合固态发酵辣木叶生产真蛋白的最优条件为：底物含水量60%、总接种量24%、温度32 °C、发酵6.5 d。本研究真蛋白产量最高的发酵条件为：底物含水量55%、温度38 ℃、发酵5 d。说明不同菌种组合固态发酵所适用的生产条件不一致，主要取决于微生物和发酵底物自身的特性。鲜酒糟水分较高且易变质，及时处理可缩短生产周期。本试验中，发酵时间4 d，真蛋白产量水平保持较高，且A3B1C3组与A1B3C2组间真蛋白产量无显著差异。同时，对生产过程中酒糟的底物含水量进行选择，发现A3B2C2组与A1B3C2组条件下真蛋白产量无显著差异，且前者可节约预干燥时间和能源。因此，含水量55%、温度35 ℃、4 d的发酵条件更适合在生产实际中应用。3.3车间大规模固态发酵对白酒糟中营养含量的影响SSF能够提供微生物适宜的生长环境，产生废物少且成本低，适用于商业化生产[28]。本研究表明，标准车间固态发酵后酱香型白酒糟中的真蛋白和粗蛋白质含量比发酵前分别提高16.44%、4.78%，与范恩帝等[22]、宋善丹等[29]的研究一致，验证前期阶段的研究结果。但真蛋白的提升幅度较Zhu等[30]、张玉诚等[18]的研究结果低，因为生产过程中未添加额外的氮源，供微生物转化利用的非蛋白氮有限。本试验结果显示，固态发酵后白酒糟中的钙含量较发酵前显著提升，粗纤维和有机物显著降低，与前人报道一致[18,21,31-32]。酿酒酵母和曲霉属菌具有分泌淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力，可协同作用扰乱纤维-淀粉-蛋白质基质的结构，将部分木质纤维素分解为单糖，微生物利用单糖增殖产生更多有益的代谢物，提高酱香白酒糟中粗纤维的利用率。由于微生物发酵过程中释放二氧化碳造成有机物损失，所以无机物中钙含量会相对提高。因此，本研究所筛选的菌种组合和固态发酵工艺提供一种提高酱香型白酒糟利用率的有效途径。3.4固态发酵对白酒糟中的霉菌毒素含量的影响霉菌毒素是霉菌在生长繁殖过程中产生的次级代谢产物，存在于饲料及各类谷物原料。鲜酒糟由谷物原料厌氧发酵产生，储存不当或时间过长易受黄曲霉毒素B1和呕吐毒素等霉菌毒素污染[33]。霉菌毒素通过影响动物的各种生理特性发挥毒性，如诱导氧化应激[34-35]、介导细胞凋亡[36]和调节信号通路[37-38]等，含量超标会导致家畜的免疫机能下降，导致死亡。研究发现，酵母菌和曲霉菌属对降解饲料中黄曲霉毒素B1水平具有一定潜力[39-40]，关于酵母菌和曲霉菌属对呕吐素的降解作用暂未见报道。本研究结果表明，SSF后白酒糟中的黄曲霉毒素B1含量比发酵前无显著变化，呕吐素含量约为发酵前的3倍。微生物降解霉菌毒素的过程主要通过吸附或酶促降解实现，降解效率取决于微生物的类型和分泌的酶类型、pH值、温度、毒素的初始浓度以及环境中其他化学物质。本研究中，添加微生物菌种对白酒糟中的霉菌毒素无降解作用，可能与菌种本身产酶特异性以及SSF过程中控制的条件有关，还需进一步研究。但固态发酵生产后的黄曲霉毒素B1和呕吐素含量远低于饲料标准水平，对动物无不良影响。3.5发酵酒糟对断奶羔羊生长性能的影响平均日增重是衡量动物生长速度的主要指标，料重比直接反映畜禽对饲粮的利用效率，干物质采食量因饲粮的营养水平及适口性变化而改变。本研究结果表明，在断奶羔羊基础饲粮中加入MFFDG能够明显提升平均日增重，降低料重比，与曹广等[41]的研究结果一致。汪成等[7]研究表明，MFFDG可明显提升肉牛的平均日增重，降低料重比。本试验结果表明，MFFDG对断奶羔羊的平均日采食量无显著影响，与汪成等[7]、陈光吉等[42]的研究结果不一致，原因可能是本试验使用的均为颗粒型干饲粮，其高营养含量和适口性有助于断奶羔羊采食，故加入发酵酒糟后各组间差异不显著。王勇等[43]在育肥牛全价颗粒日粮中加入发酵白酒糟，结果发现，白酒糟对育肥牛的采食量无影响。4结论利用不同菌种固态发酵白酒糟生产反刍动物优质饲料是可行的。酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉组合以及优化条件下，规模化固态发酵可以显著提升白酒糟的营养价值，且毒素含量较低。基础日粮中添加MFFDG可有效提升断奶羔羊的生长性能，以每日添加50 g的效果最好。。