抗生素作为饲料添加剂,在促进动物生长、预防疾病等方面发挥着重要作用。但抗生素在畜禽生产中广泛应用而导致畜产品的抗生素残留以及超级耐药菌的产生等问题,严重危害动物源食品安全以及公共卫生安全[1-2]。随着国内发布的禁止促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)在商品饲料中应用的政策实施[3],寻找一种可替代抗生素的天然产物对畜牧养殖行业极为重要。苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是一种存在于天然蜂蜜中的酚酸,具有广谱的抗菌特性[4],在食品、医药、材料等领域应用广泛[5-9]。日粮中添加PLA可以抑制细菌生长[10],促进动物生长[11],调节畜禽免疫功能[12-13],起到维持畜禽健康和提高生产性能的作用。虽然PLA尚未被列入《饲料添加剂品种目录》(2013)中,但其生产菌株如枯草芽孢杆菌[14]、植物乳杆菌[15]、乳酸片球菌[16]、凝结芽孢杆菌[17]、副干酪乳杆菌[18]等常作为饲料添加剂应用于畜牧生产中,PLA作为饲料添加剂具有潜在的开发利用价值。本文就PLA国内外研究现状,从稳定性、易获得性、广抑菌谱性、安全性等方面探讨了PLA的应用前景,并提出进一步的研究方向,以期为PLA在畜禽生产中的合理应用提供参考。1PLA及其理化性质PLA化学名为2-羟基-3-苯基丙酸,又称β-苯乳酸或3-苯基乳酸,其分子式为C9H10O3,相对分子质量为166[19]。PLA的第2个碳原子为手性碳原子,具有2种对映异构体,分别为L-PLA和D-PLA[19]。PLA理化性质稳定,能够耐受高温和低pH值环境[20-21],在蛋白酶作用下可保持抗菌活性[22]。因此,PLA作为抗生素替代品应用于饲料研究中可以适应制粒和蒸煮等饲料加工的高温环境,亦可适应青贮、生物发酵、动物胃肠道等环境。2PLA的合成方法目前,国内外制备PLA的方法有化学合成法和生物转化法。PLA的化学合成方法有:锌汞齐还原法、苯丙酮酸催化氢化法、双分子亲核取代反应(SN2)及不对称环氧化合成法等[23]。但化学方法存在工艺复杂、产量少、副产物多、污染环境等缺点,且提取过程中加入了毒性较大的溶剂,无法在食品和饲料行业中使用,具有一定的局限性。与之相比,生物转化法更为安全、高效,近年来学者们大多转向更为绿色安全的生物法合成PLA。2.1微生物生长代谢产物2000年,Lavermicocca等[24]首次在酸面团中分离出PLA的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),PLA产量为56.0×10-3 g/L。随后大量研究表明,自然界中存在多种微生物能够通过自身代谢合成PLA。Helena等[25]在丙酸菌(Propionibacterium acnes)代谢产物中检测到了PLA,产量为1.66×10-3~16.6×10-3 g/L。胡虹等[26]从发酵制品中筛选出一株高产PLA的短乳杆菌,通过优化培养条件,PLA产量为1.94×10-3 g/L。尽管许多种属的微生物均可通过代谢产生PLA,但生产效率低下,远达不到PLA的抑菌浓度,无法应用于商业化生产中。2.2全细胞转化法全细胞转化法是以完整的细胞作为催化剂进行化学转化,将某种前体分子转化成目标产物,实质是利用生物体系中酶的催化作用,具有反应条件温和、可重复使用、成本低和催化特异性等优点[27]。Xu等[28]研究表明,面包乳杆菌NWAFU1078具有高的重复利用性,在连续分批发酵最优条件下,全细胞催化PPA可生成3-PLA,产量为2.52 g/L,转化率为76%。王淼等[29]通过基因筛选和密码子优化,成功实现了苯丙氨酸脱氢酶(phenylalanine dehydrogenase,PHD)、LHD在枯草芽孢杆菌中的共同表达,全细胞转化L-Phe合成PLA,转化率为40%。王丹等[30]构建了一株质粒表达D-乳酸脱氢酶基因(D-LDH)和甘油脱氢酶基因(GLDH)的融合蛋白的大肠杆菌,并利用廉价的甘油进行辅酶NADH(还原型辅酶Ⅰ)的再生,实现辅酶在分子内高效传递提高催化效率,全细胞生物催化PPA合成D-PLA,产量为5.76~14.46 g/L。2.3微生物发酵法由于Phe和PPA的成本较高,全细胞催化合成PLA产业化受到了一定限制。Kawaguchi等[31]以葡萄糖为原料,利用表达反馈抑制基因pheAfbr和aroGfbr与荧光威克汉酵母TK1(W. fluorescens TK1)苯丙酮酸还原酶基因pprA相结合,成功完成了一株从头合成D-PLA的重组大肠杆菌的构建;利用2.0 L发酵罐后期补料发酵,72 h后可得7.3 g/L D-PLA。黄国昌等[32]研究表明,植物乳杆菌BLPC002最适发酵培养基组成:苯丙氨酸8.3 g/L、葡萄糖30.0 g/L、牛肉浸粉1.8 g/L,PLA产量是优化前的4.6倍,产量为1.67 g/L。PLA来源广泛,微生物发酵法作为其主要合成来源,多数微生物可合成PLA。因此,在生物饲料发酵生产过程中添加PLA产生菌,即可廉价大量获得PLA,且不会造成饲料加工升高。3PLA的抑菌谱PLA是一种具有广谱抑菌作用的小分子有机酸,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及一些真菌均具有抑制作用,对细菌和真菌的最低抑菌浓度分别为1.25~5.00 g/L、5~10 g/L。PLA的抑菌谱见表1[4]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.029.T001表1PLA的抑菌谱来源构型菌株种类指示菌株最小抑菌浓度/(g/L)抑菌机理文献来源商业—真菌烟曲霉6.50抑制真菌生长Prema等[34]匍枝根霉6.50黑曲霉8.50土曲霉8.50商业L-PLA/D-PLA真菌娄地青霉4.50抑制真菌生长和孢子形成Svanström等[35]枝孢霉5.40黑曲霉7.20食醋—G+金黄色葡萄球菌1.25破坏细胞膜宁亚维等[36]单细胞增生李斯特菌2.25破坏细胞膜枯草芽孢杆菌1.25—蜡样芽孢杆菌1.25—G-铜绿假单胞菌1.25—大肠杆菌1.25破坏基因组DNA荧光假单胞菌1.25—续表1 PLA的抑菌谱Zheng等[33]研究发现,1.5 g/L的PLA可有效抑制牛肉中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌DT104的生长。PLA能够抑制面包中的腐败霉菌,如泛青霉和黑曲霉的生长,且产PLA的菌株CRL 1753和丙酸钙协同可延长面包的保质期[34]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.029.T002来源构型菌株种类指示菌株最小抑菌浓度/(g/L)抑菌机理文献来源商业—G+单核增生李斯特菌1.25损伤生物膜Liu等[37]商业D-PLAG-荧光假单胞菌1.25损伤细胞膜和破坏DNA宁亚维等[38]脑心浸液肉汤—G+粪肠球菌5.00抑制生物膜的形成Liu等[39]商业L-PLA/D-PLAG+白色葡萄球菌2.50—刘韵昕[40]枯草芽孢杆菌2.50破坏细胞壁和细胞膜G-大肠杆菌2.50—痢疾志贺氏菌2.50—铜绿假单胞杆菌2.50破坏细胞壁和细胞膜鼠伤寒沙门氏菌2.50—L. plantarum UFG121—真菌黄色镰刀菌—抑制菌丝生长Russo等[41]L. plantarum ZJ316L-PLAG-甲型副伤寒沙门氏菌A2.00损伤细胞膜和破坏DNAZhou等[42]甲型副伤寒沙门氏菌B2.50猪霍乱沙门氏菌1.50鼠伤寒沙门氏菌2.004PLA抑菌机制多样PLA不仅可通过与病原菌细胞膜结构中的脂多糖和磷脂结合,在细胞膜表面形成电位差,破坏病原菌的细胞膜结构,从而抑制细菌的生长[40];还可通过抑制生物膜的形成,破坏DNA和抗细菌毒力相关基因的表达,从而抑制细菌生长[37-38,43]。此外,PLA还可通过抑制真菌孢子的形成和发育,抑制真菌的生长[35]。PLA的抑菌机制见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.029.F001图1PLA的抑菌机制4.1PLA对细菌的作用机制4.1.1PLA对细菌细胞抑制作用机制PLA作用细菌细胞壁后,菌体形态严重改变,细胞壁失去刚性,细胞肿胀,细菌分解,完全解体,表明PLA可能通过破坏细胞壁抑制细菌生长[34]。PLA还可以在细胞膜表面形成电位差间接作用于细胞膜,导致细胞膜被破坏。此外,PLA结构中的极性基团羟基基团能够与细胞表面蛋白结构结合刺激蛋白水解,细胞膜被破坏,从而导致细胞内成分如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、蛋白质和核酸大量泄漏[4]。4.1.2PLA对细菌生物膜抑制作用机制Liu等[39]研究发现,PLA下调了细菌黏附和胞外多糖产生的相关基因,通过干扰细菌黏附和抑制胞外多糖的分泌抑制生物膜的形成。Liu等[44]采用不同浓度的PLA与弱酸性电解水(slightly acid electrolyzed water,SAEW)联合处理克雷伯氏菌,结果发现,其细胞膜完整性以及生物膜基质被破坏,导致细胞内ATP不同程度的泄漏,表明SAEW和PLA协同作用对产酸克雷伯氏菌浮游细胞和生物膜具有抑制作用。4.1.3PLA对细菌DNA抑制作用机制PLA通过作用于细胞壁和细胞膜,进入菌体内部与DNA结合,破坏DNA构象和结构,导致DNA泄露或者影响DNA正常的合成代谢,从而抑制细菌生长[38]。Zhou等[42]的研究中,PLA与肠道沙门氏菌基因组DNA结合并嵌入核酸,导致DNA损伤,阻碍基因的表达和正常酶及受体的合成,导致细菌死亡。4.1.4PLA对细菌毒性抑制作用机制PLA可降低细菌毒力因子如溶血素、卵磷脂酶和酪蛋白酶的表达,且还可通过调节群体感应改变不同细胞过程[45]。Chifiriuc等[45]研究表明,PLA通过介导铜绿假单胞菌PAO1的群体感应系统,与其受体(RhlR和PqsR)结合,从而下调生物膜形成过程中相关毒力决定簇如绿脓菌素、蛋白酶和鼠李糖脂的表达以及抑制铜绿假单胞菌间群集运动。4.2PLA与乳酸协同作用Ning等[46]研究了PLA和乳酸对蜡样芽孢杆菌的抑菌机制,结果发现,蜡样芽孢杆菌的19个蛋白上调和11个蛋白下调;并在分子水平上对PLA的抑菌机制进行分析,发现有以下3种:下调KdpA基因,参与K+的转运,表明PLA改变了靶细胞对钾的吸收;通过上调RapG基因,抑制群体感应系统中反应调节蛋白ComA和能力基因蛋白ComK的表达,抑制细菌群体感应;下调50S核糖体蛋白L30(rpmD)和30S核糖体蛋白S13(rpmG),阻碍翻译过程。此外,PLA与乳酸协同作用机制为:通过下调基因KdpB和上调基因PstB分别抑制钾和磷的转运;通过下调5'-核苷酸酶和上调尿嘧啶磷酸核糖基转移酶改变嘌呤和嘧啶代谢阻碍DNA合成。4.3PLA对真菌的抑制作用机制PLA可以抑制孢子的形成和芽孢发育。部分研究表明,PLA通过上调产孢相关基因vosA和细胞壁蛋白PhiA的表达抑制真菌孢子的形成和发育,抑制真菌生长[35]。PLA具有多种抑菌机制,且显著区别于抗生素,并对被世界卫生组织列出对人类健康威胁最大的耐药菌如铜绿假单胞菌和大肠杆菌均具有抑制作用[45,47],PLA作为一种新型替抗产品具有很大发展前景。5PLA的安全性分析PLA是一种由公认安全的微生物乳酸菌代谢产生的第三代抑菌物质,对人和动物的细胞均不会造成伤害[48]。Chifinuc等[44]使用全直小鼠感染试验模型,发现亚抑制浓度的PLA减弱了铜绿假单胞菌的毒力和致病性,感染小鼠全部存活。Anna等[49]研究了D-PLA与羟羧酸受体3(HCA3)的蛋白质的高效激活之间联系,发现摄取乳酸菌发酵的酸菜后,D-PLA可迅速被胃肠道吸收,达到与生理相关的血浆浓度,从激活人类单核细胞中的HCA3,起到能够调节人类免疫功能的作用。Chatterjee等[50]研究了PLA的安全性,发现PLA对人肺上皮A549细胞无毒性,以最大剂量为5 g/kg给药30 d,对4~5个月大的雄性青鳉鱼无毒性作用。综上所述,PLA对动物和人体健康均具有一定益处。但目前PLA尚未被列入GRAS微生物和微生物衍生成分组合以及《饲料添加剂品种目录(2013)》中,表明PLA的安全性还不确定,对PLA及其不同剂量在各种动物模型中的许多体内安全性评价研究(急性、亚急性、亚慢性、慢性口服毒性试验、发育毒性试验和遗传毒性试验)是必要的。6PLA在饲料行业中的应用PLA是乳酸菌等微生物的重要代谢产物。PLA的各种功能已被广泛应用于食品、医药和材料等领域[5,7-8]。在食品行业中,PLA可抑制病原菌的生长,能够延长保质期,提高食品的品质[5]。在医药行业,PLA不仅是微生物拮抗剂,还是几种药物的合成前体,如降血糖药物[51]以及抗癌[52]和抗艾滋病药物[6]。其次,PLA因具有与丹参素相似的药理特征,在临床上可应用于高血压、冠心病等心血管疾病的治疗[53]。因此,PLA具有非常可靠的安全性。PLA作为乳酸菌等微生物的重要代谢产物,具有抑制细菌生长、提高生产性能、增强机体免疫力等多种生物学功能,是非常有潜力替代抗生素的产品之一[13,47,54]。研究发现,利用高产PLA的植物乳杆菌固态发酵豆粕,不仅抑制了霉菌的生长,从而延长发酵豆粕的保质期,而且提高了总酸、粗蛋白和酸溶蛋白含量,改善了发酵豆粕的品质,且发酵过程中产生的其他有机酸,能够将大蛋白降解成小分子肽,不仅满足了家畜和猪的营养需求,而且促进了动物消化吸收[10,54]。据报道,饲喂能够高产PLA的凝结芽孢杆菌固态发酵的饲料,可提高海兰褐鸡的产蛋率和平均蛋重,降低料蛋比和死淘率,抑制家禽体内大肠杆菌的生长。王春凤等[55]申请的专利《一株高产苯乳酸的植物乳杆菌及其应用》,表明饲料中添加高产PLA的植物乳杆菌可抑制饲料致病菌的生长、延长饲料的保质期、改善饲料的适口性和提高饲料的安全性,以及发酵过程中产生的有机酸促进畜禽的生长。PLA可以抑制真菌的生长和粗蛋白的降解,提高青贮饲料的品质[56]。此外,PLA可作为动物饲料的补充,PLA通过微生物转化为Phe,补充动物必需氨基酸[57]。Wang等[11]将PLA添加到断奶仔猪日粮中,发现PLA可改善断奶仔猪早期的生长性能,减少大肠杆菌的数量从而刺激断奶仔猪和保育猪的免疫系统。Wang等[12]研究了添加PLA的日粮对蛋鸡的影响,发现PLA可在短时间内提高产蛋率和改善鸡蛋品质并对蛋鸡免疫系统产生了积极影响。Kim等[13]在肉鸡日粮中添加PLA,发现PLA可改善肉鸡生长性能和肉品质,增强肉鸡的免疫特性,抑制大肠杆菌的生长。研究发现,以乳酸和PLA为主要有机酸产物的乳酸菌制剂能可以有效治疗由产肠毒素大肠杆菌引起的哺乳巧猪腹泻,改善哺乳仔猪的肠道菌群,提高断乳仔猪抗应激能力,促进仔猪生长和降低料肉比[58]。综上所述,PLA具有抑制有害菌的生长、提高生长性能和生产性能及调节免疫反应等作用。PLA可作为一种潜在替抗产品,减少抗生素在生产中的使用。7结论PLA是一种具有抑菌、促进动物生长性能和调节畜禽免疫能力等多种生理性能的小分子有机酸,作为饲料添加剂在畜禽生产中具有替抗潜能。但目前对于PLA在畜禽上的运用以及体内的作用和机制的研究相对较少。未来对PLA的研究应集中于以下方面展开:(1)PLA的安全性。虽然现已有研究报道PLA在畜禽生产中的应用效果,但研究相对较少且缺少安全性评价数据,需要更多的动物试验评估PLA在动物的体内安全性以及适宜剂量。(2)PLA的作用机制。目前关于PLA在畜禽体内的作用机制尚不完全清楚,需要探索PLA作用的分子机理。(3)PLA的来源途径。开发高效率、低成本、广来源的饲料添加剂是PLA未来的重点研究方向之一。利用从传统发酵食品中已分离的菌种,从不同畜种消化道内容物中分离纯化高产PLA菌种并进行系统的安全性评价,拓展菌种来源;利用尾菜等高水分地源性饲料资源作为发酵底物,进行产PLA菌种发酵工艺优化,进行发酵饲料产品开发和应用效果评价,不仅可以证资源有效利用,并能够降低PLA生产成本。
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