沙门氏菌病是一种具有重要公共卫生意义的疾病[1]，不仅可导致动物发病，还可能降低动物性食品的品质，甚至危害人类健康。动物食用被沙门氏菌污染的饲料是此类菌进入食物链的主要途径之一[2]。我国规定饲料产品中不得检出沙门氏菌[3]。为避免饲料被污染，须在饲料原料控制、加工工艺、储存、运输等多环节实施生物安全控制措施。及时有效地检出被沙门氏菌污染的饲料具有重要的现实意义。沙门氏菌的血清型多达2 600余种[4]，但仅部分血清型的沙门氏菌对人或动物具有致病能力。其中肠炎沙门氏菌被认为是未来控制饲料生物安全的关键血清型[5]。本研究初步建立饲料中肠炎型沙门氏菌的CPA-LFD检测法，为快速检测饲料中肠炎型沙门氏菌提供参考。1材料与方法1.1试验菌种肠炎沙门氏菌（S. enteritidis CVCC 2183）、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium CVCC 3387）、鸡白痢沙门氏菌（S.pullorum CVCC 1791）、猪霍乱沙门氏菌（S. suipestifer CVCC 2139）购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；德尔卑沙门氏菌（S. derby）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、志贺氏菌（Shigella）、芽孢杆菌（Bacillus）为沈阳市动物疫病预防控制中心保存。1.2试验材料主要试剂：质粒小提取试剂盒（天根生化科技有限公司）、dNTPs（北京索莱宝科技有限公司）10×ThermoPol® Ⅱ（Mg-free）Reaction buffer Pack（NEB有限公司）；BST DNA聚合酶、MgSO4、Betaine、无核酸酶水（生工生物工程股份有限公司）；核酸检测试纸条（杭州优思达生物技术有限公司）。主要仪器：电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）、凝胶成像系统（Tanno）。1.3试验方法1.3.1引物设计肠炎沙门氏菌血清型特异性基因Sdf Ⅰ（GenBank：AF370707.1）参考引物设计原则[6]，利用Primer Premier 5.0设计肠炎沙门氏菌属血清特异性CPA引物，参照文献[7]合成肠炎沙门氏菌PCR引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。CPA引物序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.023.T001表1CPA引物序列名称序列1s-2a5'-CTGGCGAATGGTGAGCATTTTTCTTTCTCAGATTCAGGGAGT-3'2a5'-BIO-CTGGCGAATGGTGAGCA-3'3a5'-FAM-AACAGGCTGATTTACTAAACCTT-3'4s5'-AGCCTCTTTATATAGCTCATTCT-3'5a5'-CTGGTACTTACGATGACAACTTC-3'1.3.2Sdf Ⅰ基因标准质粒的构建肠炎沙门氏菌接种到LB肉汤培养基，37 ℃培养过夜，DNA试剂盒提取基因组。使用外侧引物进行PCR扩增。胶回收PCR产物并连接至PUC 18载体，命名为PUC 18-Sdf Ⅰ，送至生工进行测序。1.3.3反应体系优化参照文献[8]设计肠炎沙门氏菌CPA基础反应体系。对反应体系中的BST DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Betaine、反应时间和反应温度等条件进行优化，设置不同浓度引物的组合[8]。琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，并确定最佳反应条件。1.3.4特异性试验使用优化后CPA反应条件检测肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、单增李斯特菌、志贺氏菌、芽孢杆菌，LFD法检测扩增产物，评价其特异性。1.3.5灵敏度试验采用无核酸酶水调整PUC18-Sdf Ⅰ质粒浓度，使目的片段终浓度为1.0×106~1.0×100 ng/L。采用CPA法扩增目的基因，LFD法检测扩增产物[9]，每个浓度重复3次。1.3.6疑似污染样品检测以养殖户提供的56份疑似污染饲料样品，采用CPA-LFD法和PCR[9]法进行检测，以国标法[10]获得的结果作为参考标准。2结果与分析2.1CPA法反应条件优化结果（见图1）由图1可知，最佳反应体系为：ThermoPoⅡ®（Mg-free）Reaction Buffer 2 μL、dNTPs 0.3 mmol/L、Mg2+ 5.0 mmol/L、Betaine 1.2 mmol/L、BST DNA聚合酶8 U、交叉引物1s-2a 1.0 μmol/L、探针2a/3a 0.5 μmol/L、外侧引物4s/5a 0.8 μmol/L、模板2 μL、无核酸酶水1.8 μL补齐。最佳反应条件为：63 ℃恒温扩增60 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.023.F001图1CPA法反应条件优化结果注：a中1~6为4.0、4.8、5.6、6.4、7.2和8.0 U；b中1~6为0、2.5、5.0、7.5、10.0和12.5 mmol/L；c中1~6为0.075、0.150、0.225、0.300、0.375和0.450 mmol/L；d中1~6为0、0.6、1.2、1.8、2.4和3.0 mmol/L；e中1~5为30、45、60、75和90 min；f中1~6为57、59、61、63、67℃和69 ℃；g中1~6为4s/5a ：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 μmol/L。2.2CPA-LFD特异性试验结果选取肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、单增李斯特菌、志贺氏菌、芽孢杆菌作为模板。使用本研究建立的CPA-LFD方法进行检测。CPA-LFD特异性试验结果见图2、图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.023.F002图2核酸试纸条特异性试验结果注：1~8分别为肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、单增李斯特菌、志贺氏菌、芽孢杆菌；C为质控线；T为检测线。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.023.F003图3琼脂糖凝胶电泳特异性试验结果注：M为DL2 000；1~8分别为肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、单增李斯特菌、志贺氏菌、芽孢杆菌。由图2、图3可知，仅肠炎沙门氏菌扩增出目的产物，其他细菌无交叉反应。结果表明，CPA-LFD方法特异性良好。2.3CPA-LFD灵敏度试验结果（见图4）使用优化后的体系和PCR方法对肠炎沙门氏菌的灵敏度进行验证。由图4可知，CPA-LFD方法的检测限为1.0×101 ng/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.023.F004图4核酸试纸条灵敏度试验结果注：1~7中模板终浓度分别为1.0×106~1.0×100 ng/L；C为质控线；T为检测线。2.4疑似污染样品检测结果（见图5）由图5可知，分别采用3种方法，对56份疑似污染样品进行检测。对每一份样品，3种方法获得的检测结果一致。共检出4份样品呈肠炎沙门氏菌阳性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.023.F005图5PCR法与CPA-LFD法检测结果注：M为DL2 000；1~4为肠炎沙门氏菌阳性样品；C为质控线；T为检测线。3讨论沙门氏菌是饲料中主要污染菌，动物食用沙门氏菌污染的饲料可引起胃肠道疾病，甚至导致死亡，对养殖业造成巨大经济损失[10]。因此，建立一种快速、特异和操作简单的检测方法对控制沙门氏菌污染具有重大意义。目前，饲料中沙门氏菌的国标检测法依赖微生物学方法，操作烦琐、耗时长[11]，无法短时间内出具检测结果。近年来，饲料中沙门氏菌的快速检测方法不断问世。快速检测方法可分为分子生物学检测法和免疫学检测法两大类[12]。分子生物学检测法普遍比免疫学检测方法的灵敏度高。但分子生物学检测法也存在不足。如PCR法[13]、real-time PCR法[14]、DHPLC法[15]所使用的仪器贵重，不适合现场快速检验；LAMP法稳定性有待提高[16]。交叉引物扩增法（crossing priming amplification，CPA）可在恒温条件下扩增目标基因片段，不需贵重仪器。应用横向流动试纸条法（lateral flow dipstick，LFD）对扩增产物进行检测，无需凝胶电泳检测过程即可实现对扩增产物的快速定性识别。交叉引物等温扩增法联合横向流动试纸条法（CPA-LFD）不依赖精密仪器，具有快速、简便、准确的特点，适合快速检测[17]。本项目初步建立了饲料中肠炎沙门氏菌的CPA-LFD检测法。建立的CPA-LFD检测法的检测限为1.0×101 ng/L，与鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、单增李斯特菌、志贺氏菌、芽孢杆菌无交叉反应。在疑似污染样品检测中，对每一份样品，3种方法获得的检测结果一致。而CPA-LFD法耗时仅70 min左右，比PCR法和国标法耗时更少，且CPA-LFD法不需要贵重仪器。研究表明，本方法可以应用于饲料中肠炎沙门氏菌的快速检测。4结论本试验表明，CPA-LFD方法最佳反应体系为反应时间60 min、反应温度为63 ℃、Betaine最佳浓度为1.2 mmol/L、Mg2+最佳反应浓度为5.0 mmol/L、BST DNA聚合酶最佳添加量为8 U、dNTPs最佳浓度为0.3 mmol/L。该条件下检测限为1.0×101 ng/L。本项目初步建立了饲料中肠炎沙门氏菌的CPA-LFD检测法。