金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属（Staphylococcus），微球菌科（Micrococcaceae）[1]，是引起奶牛乳腺组织感染炎症因子的主要因素，临床表现为奶牛亚临床乳腺炎[2-5]。金黄色葡萄球菌传染性较强，可通过附着在奶牛宿主细胞及乳腺组织，逃避免疫反应，进而释放毒素，破坏奶牛乳腺组织结构[6]。抗生素治疗乳腺组织炎症效果不佳，发病反复且存在抗生素残留问题，需要寻找新型治疗方法。茶树油是桃金娘科白千层属灌木树种—互生叶白千层（Melaleuca leucadendron L.）的新鲜枝叶经水蒸气蒸馏得到的芳香精油，具有抗菌活性和抗炎等作用[7]。从互生叶白千层提取的茶树油成分主要包括：萜品油烯-4—醇、γ-萜品烯、桉树脑、α-萜品醇、α-萜品烯[8]。茶树油的抗菌活性取决于细胞膜通透性增强的能力和破坏细菌细胞膜的结构和功能[9-10]。研究发现，茶树油对常见的致病菌：金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠埃希菌及绿脓杆菌具有较好的抗菌活性，还具有低毒、安全、无刺激性等优点[11-12]。陈昕等[13]研究发现，茶树油可诱导大鼠脾淋巴细胞增殖，明显增强大鼠的免疫功能。陈志等[14]研究发现，茶树油对脂多糖诱导的奶牛乳腺炎具有一定的拮抗作用，并能够降低炎症因子和凋亡因子的相关蛋白表达量，降低细胞凋亡数目，提高正常细胞存活比例。杨培川等[15]研究发现，在保育猪的不同生产阶段的饲粮中添加适量的茶树油，能够起到降低料重比，提高猪的生产性能和肉品质的作用。目前，关于茶树油对体外培养奶牛乳腺组织先天免疫反应影响的研究较少。本试验旨在通过体外培养的方式，探究茶树油对感染金黄色葡萄球菌的奶牛乳腺组织炎症反应相关基因表达的影响。1材料与方法1.1试验材料茶树油购自无锡市晨芳生物科技有限公司。茶树油成分见表1。奶牛乳腺组织细胞由扬州大学动物培养物保藏应用研究所提供。试验使用的仪器及试剂均由扬州大学动物科学与技术学院提供。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.004.T001表1茶树油成分表成分含量/%松油醇-460.0对伞花烃5.0~10.0桉叶素2.0~10.0α-松油醇3.0α-松油烯10.0α-派烯0.51.2试验方法取健康荷斯坦奶牛乳腺组织，清洗后剪碎至1 mm×1 mm×1 mm。将组织块种植至6孔板，在5%二氧化碳培养箱中37 ℃培养12 h，组织贴壁后添加2 mL含有金黄色葡萄球菌（1×106 CFU/well）DMEM/F12培养基（对照组）；添加含0.05%茶树油和金黄色葡萄球菌（1×106 CFU/well）的DMEM/F12培养基（茶树油组），每组3个重复，培养6 h。1.3测定指标及方法1.3.1总RNA提取按照总RNA提取试剂盒说明提取总RNA。1.3.2反转录cDNA按照Takara反转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA。1.3.3荧光定量PCR引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.004.T002表2引物序列基因引物序列（5'→3'）序列号大小/bpIL-1βF：CAGTGCCTACGCACATGTCTR：AGAGGAGGTGGAGAGCCTTCNM_174093.1209IL-8F：TGGGCCACACTGTGAAAATR：TCATGGATCTTGCTTCTCAGCNM_173925.2136IL-6F：TCCTTGCTGCTTTCACACTCR：CACCCCAGGCAGACTACTTCNM_173923.2129TNF-αF：GCCCTCTGGTTCAGACACTCR：AGATGAGGTAAAGCCCGTCANM_173966.3192TLR-2F：CAGGCTTCTTCTCTGTCTTGTNM_174197.2140R：CTGTTGCCGACATAGGTGATATLR-4F：GACCCTTGCGTACAGGTTGTR：GGTCCAGCATCTTGGTTGATNM_174198.6103β-caseinF：GTGAGGAACAGCAGCAAACAR：TTTTGTGGGAGGCTGTTAGGNM_181008.2115κ-caseinF：CCAGGAGCAAAACCAAGAACNM_174294.2148R：TGCAACTGGTTTCTGTTGGTαs1-caseinF：AATCCATGCCCAACAGAAAGR：TCAGAGCCAATGGGATTAGGNM_181029.2189GPADHF：GGGTCATCATCTCTGCACCTR：GGTCATAAGTCCCTCCACGANM_001034034.2176PCR反应体系（20 μL）：SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit 10 μL、上游和下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL、cDNA模板 100 ng和灭菌蒸馏水。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，每个样品3个重复且使用GAPDH作为内参。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳分离，随后在凝胶成像仪中观察PCR产物。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 23.0统计软件中进行单因素方差分析（One way-ANOVA），采用独立样本t检验完成差异显著性检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1茶树油对奶牛乳腺上皮细胞炎症细胞因子的mRNA表达量的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，经茶树油处理后奶牛乳腺上皮细胞中TNF-α和IL-1β mRNA表达水平均极显著下降（P0.01），TLR-2显著下降（P0.05），IL-8 mRNA的表达量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.004.T003表3茶树油对奶牛乳腺上皮细胞炎症细胞因子的mRNA表达量的影响项目金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌+茶树油P值TLR-21.00±0.07A0.64±0.02B0.01TLR-41.00±0.090.71±0.060.06TNF-α1.00±0.02A0.34±0.02B0.00IL-1β1.01±0.11A0.38±0.01B0.00IL-61.01±0.100.83±0.040.16IL-81.02±0.14b1.67±0.09a0.02注：1.通过qRT-PCR分析TLR-2、TLR-4、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表达量，GPADH作为内参。2.同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2茶树油对酪蛋白基因表达的影响（见表4）由表4可知，茶树油组奶牛乳腺上皮细胞β-casein mRNA的表达量显著提高（P0.05），对照组和茶树油组的κ-casein mRNA表达量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.004.T004表4茶树油对酪蛋白基因表达的影响项目金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌+茶树油P值β-casein1.01±0.04b3.39±0.47a0.04κ-casein1.01±0.080.77±0.020.103讨论3.1茶树油对奶牛乳腺上皮细胞炎症细胞因子的mRNA表达量的影响TLRs是免疫系统重要的受体家族，通过识别致病源保守序列，激活体内免疫系统，启动一系列的免疫炎症反应[16-17]。TLR-2和TLR-4能够分别识别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌[18]。茶树油通过抑制TLR-2激活奶牛乳腺组织的先天免疫反应。细菌侵入奶牛乳腺细胞后激活巨噬体内细胞释放大量TNF-α，刺激并促进中性粒细胞呼吸爆发，释放一氧化氮损伤奶牛乳腺组织[19]，加剧机体炎症反应。IL-1β是奶牛体内重要的促炎性调节因子，基因多态性与炎症的严重程度有关，能够刺激单核细胞和巨噬细胞产生IL-6，趋化中性粒细胞。上皮细胞受到刺激会大量分泌IL-8，趋化体内参与特异性和非特异性的免疫细胞，激活中性粒细胞到达感染部位，参与炎症损伤[20-21]。Nogueira等[22]研究发现，茶树油成分可通过干扰NF-κB、p38或ERK-MAPK途径，抑制人巨噬细胞产生炎症介质IL-1β、IL-6和IL-10的分泌。耿欣等[23]研究发现，茶树油能够抑制炎症因子产生，增强中性粒细胞活性，减轻炎症造成的机体损伤。马晓宇等[24]研究表明，低浓度的茶树油对奶牛瘤胃细胞炎症因子的基因表达具有显著抑制作用。Zhan等[25]研究发现，使用茶树油可通过降低IL-1β、IL-6和TNF-α表达量，促进中性粒细胞迁移，减轻奶牛乳腺上皮细胞炎症损伤。本试验结果表明，添加0.05%茶树油组奶牛乳腺上皮细胞中TLR-2、TNF-α及IL-1β基因表达量水平均显著下降，TLR-4、IL-6基因表达量无显著差异，说明茶树油对金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症具有一定的缓解作用。3.2茶树油对酪蛋白基因表达的影响牛奶中的酪蛋白质代表奶牛乳腺合成乳蛋白的能力，分为4种，即αs1-casein、αs2-casein、β-casein、κ-casein组成。β-casein不仅是酪蛋白的重要组成部分，而且是mTOR翻译起始途径的最终产物[26]。研究表明，在中国荷斯坦奶牛群体中，κ-casein B等位基因能够改良奶牛乳脂率性状的分子遗传标记[27]。植物提取物含有多种活性成分，对健康奶牛以及患乳腺炎奶牛乳蛋白率具有改善作用。金亚亚等[28]研究表明，100 μg/L雌激素和200 μg/L催乳素联合添加对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白的合成促进效果较好。宋洁等[29]研究发现，饲粮中添加含有金银花、益母草、连翘、蒲公英的复合植物提取物能够在一定程度上提升患乳腺炎奶牛的乳中蛋白质含量、改善乳品质和增强机体抗炎能力。胡耀等[30]研究发现，12 mg/L黄花蒿乙醇提取物对脂多糖诱导损伤奶牛乳腺上皮细胞活性和乳蛋白合成有较好的预保护效果。本研究结果表明，添加0.05%茶树油会显著提高感染金黄色葡萄球菌的乳腺组织β-casein mRNA水平，但是并未显著改变κ-casein mRNA表达量。4结论添加0.05%的茶树油可以降低感染金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎症中促炎性因子mRNA的表达，提高β-casein基因在奶牛乳腺组织中的表达水平。因此，茶树油在预防和缓解奶牛乳房炎症方面有一定作用，但是其作用机制、使用方法、添加量等方面还待进一步探讨。