目前，养驴业逐渐从役用向肉用及乳用方向转变[1]。驴驹阶段机体免疫机能尚未发育完全，抵抗力较差，易受环境影响，饲养管理不当，影响存活率及生长性能。热应激指当动物处于高温环境中所表现出的一系列非特异性生理反应的总和[2]。热应激会引起家畜采食量和免疫功能的下降，造成生长性能和生产性能下降[3-5]。血清生化指标反映动物机体代谢和某些组织器官机能状态变化的一个重要特征[1]。血清中的酶具有器官特异性，活性与组织器官的功能和代谢水平密切相关，碱性磷酸酶（ALP）、谷草转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）的活性能够反映肝脏功能。研究表明，热应激会导致肝脏损伤，使血清中ALP、AST和LDH的活性提高[6-7]。王松波等[8]研究发现，处于热应激的肉鸡抗氧化能力和平均日增重均显著下降，热应激会导致动物机体内自由基增多，破坏体内抗氧化酶系统，导致机体抗病力下降，严重时引发各种病理症状。在山羊的研究中，发现热应激可导致其免疫功能和抗氧化能力显著下降[9]。目前，关于驴驹热应激缓解措施的研究报道较少。因此，本试验旨在研究圈舍中提供喷淋和风扇对夏季驴驹血清生化指标、抗氧化功能及相关基因相对表达量的影响，为驴驹热应激缓解措施提供参考。1材料与方法1.1试验地点及时间试验于2020年7月份在内蒙古呼和浩特市内蒙古草原御驴科技牧业有限公司进行。1.2试验设计选取24头出生日龄（51.95±2.24）d和体重（56.80±5.34）kg相近的健康三粉驴驹，随机分为4组，每组6个重复（公、母各半），每个重复1头驴驹。试验分为对照组、喷淋组、风扇组、喷淋+风扇组。试验期28 d，每日7：00和14：00饲喂相同的饲料。其余时间自由吮食母乳。基础饲粮组成和营养水平见表1。试验期每天11：00~17：00开启风扇，每隔1 h进行1次喷淋，每次喷淋2 min。试验驴自由采食和饮水。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.026.T001表1基础饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00苜蓿草50.00消化能/(MJ/kg)12.02玉米31.10干物质/%85.44次粉2.00粗蛋白质/%11.14豆粕6.40粗脂肪/%5.55DDGS3.76粗灰分/%6.87膨化全脂大豆4.00中性洗涤纤维/%46.70食盐0.50酸性洗涤纤维/%26.36石粉0.56钙/%1.24磷酸氢钙1.10磷/%0.51预混料0.20碳酸氢钙0.38注：1.每千克预混料为饲粮提供：Fe 10 g、Cu 20 g、Mn 10 g、I 120 mg、Se 70 mg、Co 60 mg、VA 1 500 000 IU、VD3 600 000 IU、VE 3 000 IU、VK 4 460 mg、VB1 80 mg、VB2 1 900 mg、VB6 200 mg、烟酸4 500 mg、D-泛酸3 700 mg、VB12 12 mg、生物素56 mg、叶酸510 mg。2.营养水平均为实测值。1.3测试指标及方法1.3.1驴舍环境指标试验期每天8：00、14：00和20：00使用HW-200温湿度记录仪、CFGD5叶轮式风速仪、MR-5型辐射热计，记录试验环境中的温度、湿度、风速和辐射热，且测量高度均为畜体高度，将驴舍28 d内3个时间点的各指标分别取平均值，利用28 d的平均值进行统计分析。1.3.2样品采集试验第14和28 d的早晨和中午，饲喂前于颈静脉用普通真空采血管采血10 mL，在4 ℃静置30 min，3 500×g离心10 min分离血清，分装，-20 ℃保存。1.3.3血清生化指标血清中碱性磷酸酶（ALP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）活性、总胆红素（TBIL）、肌酐（CRE）、尿素（UREA）含量采用HITACHI日立7020型全自动生化分析仪测定。1.3.4血清抗氧化指标血清中丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性、总抗氧化能力（T-AOC）采用试剂盒测定。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，具体方法参照说明书进行。1.3.5抗氧化指标基因表达量采用Trizol法从白细胞中提取总RNA。提取出的总RNA采用核酸定量仪在260和280 nm处测定浓度和纯度。总RNA通过Hifair®Ⅱ 1st Strand试剂盒（Yeasen Biotech）逆转录为cDNA；将β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因，通过罗氏LightCycler®96qPCR仪和Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒（Yeasen Biotech）实时定量PCR，各样品重复数为2。程序设定如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，退火60 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。采用2-△△Ct法计算CAT、谷胱甘肽转移酶3（GSH-Px3）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）的相对表达量。引物序列见表2。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计，并由北京六合华大基因科技有限公司合成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.026.T002表2引物序列基因名称登录号引物序列（5'→3'）长度/bpβ-actinAF035774.1F：ATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATC137R：GCTGTGATCTCCTTCTGCATCCTGCATXM_014729341.2F：TCAACAGTGCCAACGAGGACAAC150R：AGTTCTTGACCGCTTTCTTCTGGATGGSH-Px3NM_001115158.1F：TCCCACTCACCCTCAAGTATGTCC98R：CTTCTGCTCTTTCTCCCCGTTCACSOD1NM_001081826.3F：AACCAAAGGCGATCACGGATTCC130R：GTCACATTGCCCAGGTCTCCAACSOD2NM_001082517.2F：GTTGACTGCTGTATCGGCTGGTG98R：GGTTAGGACAGGCAACAATCTGGAG1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2019进行整理，SAS 9.2统计软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1夏季福利化管理对驴舍环境指标的影响（见表3）由表3可知，试验各组与对照组在8：00、14：00和20：00的平均温度、平均湿度与平均热辐射均无显著差异（P0.05）；风扇组与喷淋+风扇组风速极显著高于对照组与喷淋组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.026.T003表3夏季福利化管理对驴舍环境指标的影响项目时间对照组喷淋组风扇组喷淋和风扇组SEMP值温度/℃08：0022.4022.6622.7322.770.130.26414：0030.9630.9730.3630.570.280.38020：0025.3125.0324.9724.900.380.879湿度/%08：0065.8966.0663.9765.390.660.18814：0041.5742.0441.7242.300.760.90320：0057.2658.6955.2555.992.410.763风速/(m/s)08：000.150.120.200.150.040.65514：000.19B0.23B1.64A1.72A0.030.00120：000.100.150.130.180.040.652辐射热/(kw/m2)08：000.0190.0190.0220.0260.0100.78214：000.1260.1070.0960.1230.0100.140注：同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2夏季福利化管理对驴驹血清生化指标的影响（见表4）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.026.T005项目对照组喷淋组风扇组喷淋和风扇组SEMP值TBIL/(mmol/L)第14 d4.254.254.754.750.200.115第28 d4.334.424.334.170.150.679CRE/(μmol/L)第14 d70.94a64.31b63.79b62.81b1.730.015第28 d72.23a65.06b64.02b45.47b1.970.028UREA/(μmol/L)第14 d6.805.995.996.730.440.422第28 d6.586.745.765.950.380.216LDH/(U/L)第14 d50.5247.0045.3245.802.820.568第28 d50.74A44.76A36.31B35.59B2.400.001由表4可知，试验第28 d，与对照组相比，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹血清中ALP活性显著下降（P0.05）；试验第28 d，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹血清AST活性极显著低于对照组与喷淋组（P0.01）；试验第14 d与28 d，与对照组相比，试验各组驴驹血清中CRE含量显著降低（P0.05）；试验第28 d，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹血清LDH活性极显著低于对照组与喷淋组（P0.01），其余指标无显著变化（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.026.T004表4夏季福利化管理对驴驹血清生化指标的影响项目对照组喷淋组风扇组喷淋和风扇组SEMP值ALP/(U/L)第14 d237.18231.00217.10228.7010.940.440第28 d255.64a240.30ab214.40b210.20b11.150.030AST/(U/L)第14 d330.60307.80303.60307.0017.100.672第28 d347.10A355.18A286.90B281.30B12.290.001ALT/(U/L)第14 d10.308.649.009.300.480.249第28 d10.2510.558.919.420.700.368续表4　夏季福利化管理对驴驹血清生化指标的影响2.3夏季福利化管理对驴驹血清抗氧化指标的影响（见表5）由表5可知，试验第14 d和28 d，与对照组相比，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹血清中GSH-Px活性显著升高（P0.05），试验各组驴驹血清中CAT与T-SOD活性显著或极显著升高（P0.05或P0.01）。与对照组相比，试验第14 d，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹血清中MDA含量显著降低（P0.05）；试验第28 d，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹血清中MDA含量显著低于对照组与喷淋组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.026.T006表5夏季福利化管理对驴驹血清抗氧化指标的影响项目对照组喷淋组风扇组喷淋和风扇组SEMP值GSH-Px/(U/mL)第14 d316.10b345.11ab367.83a383.20a12.910.011第28 d306.60b333.97ab350.11a347.10a11.260.038CAT/(U/mL)第14 d3.56b4.24a4.30a4.48a0.180.013第28 d3.38b3.84a3.82a3.83a0.130.050T-AOC/(U/mL)第14 d0.240.240.250.250.010.843第28 d0.220.230.230.250.010.464T-SOD/(U/mL)第14 d109.10b127.50a131.40a127.30a5.660.037第28 d110.30B126.30A138.00A139.80A4.340.001MDA/(μmol/L)第14 d2.18a1.81ab1.72b1.72b0.120.043第28 d2.43a2.33a2.02b1.88b0.090.0022.4夏季福利化管理对驴驹抗氧化相关基因相对表达量的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，试验第14 d，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹CAT基因的相对表达量显著升高（P0.05）。试验第28 d，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹白细胞GSH-Px3基因的相对表达量显著升高（P0.05）；试验第14 d，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹白细胞SOD1基因的相对表达量显著升高（P0.05），试验第28 d，风扇组与喷淋＋风扇组白细胞SOD1基因的相对表达量极显著高于对照组与喷淋组（P0.01）；试验第14和28 d，风扇组与喷淋＋风扇组白细胞SOD2基因的相对表达量极显著高于对照组与喷淋组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.07.026.T007表6夏季福利化管理对驴驹抗氧化相关基因相对表达量的影响项目对照组喷淋组风扇组喷淋和风扇组SEMP值CAT第14 d1.00b1.06ab1.32a1.34a0.090.021第28 d1.001.061.231.240.080.096GSH-Px3第14 d1.001.071.121.210.080.387第28 d1.00b1.11ab1.31a1.28a0.090.047SOD1第14 d1.00b1.06ab1.29a1.25a0.080.042第28 d1.00B1.13B1.43A1.44A0.090.001SOD2第14 d1.00B1.12B1.55A1.47A0.070.001第28 d1.00B1.12B1.51A1.54A0.100.0013讨论3.1夏季福利化管理对驴驹血清生化指标的影响血清生化指标是反映动物内环境稳态的重要参数[10]，反映机体健康、营养水平及机体代谢情况。ALP作为肝脏损伤的一个重要评估指标，在肝胆系统出现病变、胆汁淤积时，病变周围的肝细胞过度释放或者胆管梗阻导致无法排入肠道而分泌入血，血清ALP活性会升高[11]。AST和ALT在机体的蛋白代谢中发挥着重要的作用，血清中转氨酶及碱性磷酸酶的活性在一定程度上均与肝脏受损情况相关[12]。侯引绪等[13]研究表明，热应激能够显著提高奶牛血清中ALP的活性。陆壮[14]研究发现，热应激能够显著提高肉鸡血浆中AST的活性。本试验中，与对照组相比，风扇组与喷淋＋风扇组能够显著降低驴驹血清中ALP与AST活性，表明添加风扇与喷淋＋风扇设施能够降低高温对驴驹肝脏的损伤。CRE是肌酸磷酸酯在肌肉和蛋白质代谢中的分解产物[15]，反映机体蛋白质分解和肝脏氮素循环情况的指标。机体CRE主要经肾小球滤过后排出体外，肾小球的滤过能力可决定血清CRE浓度。肾小球滤过能力下降，血清CRE浓度升高[16]。侯引绪等[13]研究表明，中度热应激组奶牛血清中CRE的含量高于非热应激组，可能是因为热应激导致奶牛呼吸加快、汗量增加、排尿量增加。本试验中，与对照组相比，试验各组驴驹血清中CRE的含量均显著下降，可能是喷淋和风扇增加驴驹的对流散热和传导散热，减少驴驹排汗量，增加排尿量，使过多的CRE通过尿液排出，降低血清中CRE的含量。机体一些组织器官病变可改变其组织器官本身的LDH活性，使血清中LDH活性改变，影响机体能量代谢，糖代谢途径从产生大量能量的有氧氧化向无氧酵解方向转变[17]。研究发现，热应激会导致奶牛和公羊血清中LDH活性升高，可能是由于热应激增强细胞膜通透性和能量代谢的无氧酵解过程，引起血清中LDH活性升高[18-19]。本试验中，与对照组相比，风扇与喷淋＋风扇组驴驹血清中LDH的活性显著下降，可能是因为添加风扇及喷淋＋风扇的设施能够减少高温对组织的损伤。3.2夏季福利化管理对驴驹血清抗氧化指标及其相关基因相对表达量的影响抗氧化酶系统包括SOD、CAT和GSH-Px等。机体内有含铜锌的CuZn-SOD以及含锰的Mn-SOD，CuZn-SOD主要分布于细胞液中，Mn-SOD主要分布于线粒体基质中。SOD可将·O2-与氢离子结合生成H2O2和O2，也能够催化·O2-发生歧化反应生成O2和水；CAT可将H2O2分解为水和O2；GSH-Px活性中心是硒半胱氨酸，该酶可以催化GSH变成GSSG，使有毒的H2O2还原成无毒的羟基化合物[20]。抗氧化酶系统不断地清除机体产生的自由基，正常情况下自由基产生和清除处于动态平衡中，保护机体免受氧化应激损伤。当机体由于温度过高产生热应激时，抗氧化酶活性下降，不能及时清除体内自由基，可破坏细胞结构，使生物膜中不饱和脂类形成脂质过氧化物，最终产物是MDA，因此其含量可间接反映自由基产生和组织细胞损伤程度[21]。Megahed等[22]研究发现，热应激可显著降低水牛血清SOD活性和T-AOC。张灿等[23]研究发现，湿热应激使藏绵羊和山羊血清SOD和GSH-Px活性及T-AOC显著降低，MDA含量显著升高。Yang等[24]研究表明，热应激加剧动物机体氧化反应，使脂质过氧化物MDA积累，引起细胞膜氧化损伤。本次验中，与对照组相比，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹血清中T-SOD、GSH-Px及CAT的活性显著升高，MDA的含量显著降低，喷淋组驴驹血清中CAT与T-SOD活性显著升高，表明添加喷淋与风扇的降温措施能够提高驴驹抗氧化酶活性，减少MDA的产生，从而减少机体的氧化应激。研究表明，Nrf2信号途径被机体产生的H2O2激活，H2O2经SOD转化而来，并通过增加HO-1、CAT、SOD和GSH-Px等抗氧化酶的基因或蛋白表达来缓解应激[25]。石璐璐等[26]研究表明，热应激能够降显著低白细胞中CAT、SOD2和Nrf2基因的相对表达量。研究表明，当机体处于长期热应激时会抑制Nrf2信号通路激活，使其下游CAT、SOD和GPx等抗氧化酶的基因表达降低[27-28]。本试验中，与对照组相比，风扇组与喷淋＋风扇组驴驹白细胞中CAT、SOD1、SOD2及GSH-Px3的基因的相对表达量显著上升，可能是添加风扇与风扇＋喷淋设施缓解高温对驴驹影响，从而促进Nrf2信号通路的激活，并使下游抗氧化酶的基因表达上升，提高其抗氧化酶活性，缓解驴驹氧化应激。4结论驴舍中增设喷淋和风扇能够缓解高温环境对驴驹血清生化指标的影响，提高血清抗氧化酶活性，降低MDA含量，上调抗氧化酶相关基因的相对表达量，增设风扇设施的效果相对较好。