细菌内毒素是1种致热源，也是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的1种组分，在临床上易引起哺乳动物发热反应等症状，具有耐热性强、可过滤性、不挥发性等特点。细菌内毒素是注射用原料药生产厂通常面临的问题之一，对易引入内毒素的药品和医疗器械等出厂前必须进行内毒素检测[1-3]。盐酸头孢噻呋（ceftiofur hydrochloride）是由美国法玛西亚普强公司开发的第一个专门用于动物的第三代头孢菌素类抗生素，分子式为C19H17N5O7S3·HCl。盐酸头孢噻呋具备抗菌活性强、抗菌谱广、β内酰胺环稳定性好、毒副作用小、残留量低、不易产生耐药性或者交叉耐药性等优点，在一定程度上解决了耐药菌问题。近年来，盐酸头孢噻呋制剂在世界各地兽医临床中广泛应用于防治猪、牛、羊及雏鸡的呼吸系统等疾病[4-5]。为填补盐酸头孢噻呋无菌原料检查标准的空白，更好地对该原料进行安全性评价和质量控制，确保其无菌制剂临床用药的安全性，本试验对盐酸头孢噻呋无菌原料的细菌内毒素检查进行了方法学研究。1材料与方法1.1试验材料盐酸头孢噻呋无菌原料分别由齐鲁晟华制药有限公司（批号：711067118211、80671025A、605067105011）和艾美科健生物医药有限公司（批号：PS077-1712025、PS077-1802001、PS046-1802001、PS046-1802002）提供。1.2主要仪器XPE205型电子天平（梅特勒公司）、DK-8AX型恒温水槽（上海精密仪器仪表有限公司）、Vortex Genie2旋涡混合器（Scientific Industries）、DHG-9076A电热鼓风干燥箱（上海精宏仪器有限公司）、HG-50型全自动灭菌锅（HIRAYAMA株式会社）；移液器、无热源吸头、试管、试管架、洗耳球、玻璃移液管、封口膜等。1.3主要试剂鲎试剂购自福州新北生化工业有限公司，灵敏度（λ）为0.125 EU/mL，规格为0.1 mL/支，批号：18080912。细菌内毒素工作标准品购自福州新北生化工业有限公司，效价为10 EU/支，批号：160905。细菌内毒素检查用水购自福州新北生化工业有限公司，批号：18090105。1.4试验方法1.4.1试验准备试管、试管架、玻璃移液管等耐高温器皿置于电热鼓风干燥箱，250 ℃干烤60 min以上；洗耳球等置全自动灭菌锅中灭菌；所用试剂安瓿外壁以75%酒精擦拭干净。1.4.2鲎试剂灵敏度复核试验1.4.2.1细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，加入细菌内毒素检查用水1.0 mL溶解，涡旋混匀15 min。细菌内毒素检查用水进行40、80、160、320倍稀释，每稀释一步均需涡旋混匀30 s，制备成4个浓度（2.00、1.00、0.50、0.25 λ）的细菌内毒素标准溶液。1.4.2.2试验操作取备好的鲎试剂18支各加入0.1 mL细菌内毒素检查用水溶解。取其中16支，分为4组，4个浓度的内毒素标准溶液各为1组；每组4支平行，每支分别加入对应浓度的内毒素标准溶液0.1 mL；其余的2支作为阴性对照，各加入0.1 mL细菌内毒素检查用水。37 ℃恒温水槽保温60 min，轻轻取出并缓缓倒转180°，观察结果。1.4.3鲎试剂灵敏度测定值计算计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度测定值。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度[6]。λc=lg-1（ΣX/n）（1）式中：X为反应终点浓度的对数值（lg）；n为每个浓度的平行管数。1.4.4干扰试验1.4.4.1细菌内毒素标准对照溶液的制备制备方法同1.4.2.1。1.4.4.2供试品溶液的制备本试验供试品为无菌原料药，最大有效稀释倍数（MVD）为1，细菌内毒素限值（L）为1.0 EU/mg，根据公式[6-7]MVD=CL/λ，计算供试品的最小有效稀释浓度为0.125 g/L。精密称取盐酸头孢噻呋50 mg，采用2.6%无内毒素的碳酸钠溶液1.0 mL溶解，加入细菌内毒素检查用水1.0 mL制成25 g/L的溶液，精密移取上述浓度溶液适量，采用细菌内毒素检查用水分步稀释成终浓度为0.125 g/L的供试品溶液。1.4.4.3含细菌内毒素的供试品溶液的制备以1.4.4.2项下制备好的0.125 g/L的供试品溶液为稀释用液，将1.4.4.1项下的同支细菌内毒素工作标准品进行分步稀释，分别制备成含2.00、1.00、0.50、0.25 λ细菌内毒素的供试品溶液。1.4.4.4干扰试验溶液的制备取准备好的鲎试剂28支放在试管架上，各加入0.10 mL细菌内毒素检查用水溶解，排成10列（6列2支，4列4支）。其中1列2支为阴性对照组，各加入细菌内毒素检查用水0.10 mL；另1列2支为供试品溶液组，各加入0.10 mL供试品溶液；其余的4列2支为内毒素标准对照溶液组，每支分别加入0.10 mL的2.00、1.00、0.50、0.25 λ的细菌内毒素标准对照溶液；4列4支为干扰试验组，每列每支分别加入0.10 mL的含2.00、1.00、0.50、0.25 λ细菌内毒素的供试品溶液。置于37 ℃恒温水槽保温60 min，轻轻取出并缓缓倒转180°，观察结果。1.4.5供试品的细菌内毒素检测（凝胶限度试验）1.4.5.1溶液制备按1.4.4.1方法制备2.00 λ浓度的细菌内毒素标准对照溶液；按1.4.4.2方法分别制备从两个厂家收集到的7批供试品，作为供试品溶液；按1.4.4.3方法制备含2.00 λ细菌内毒素的供试品溶液。1.4.5.2凝胶限度试验取准备好的8支鲎试剂各加入0.1 mL细菌内毒素检查用水溶解，排成4列，每列2支。其中1列2支为阴性对照组，各加入0.1 mL细菌内毒素检查用水；1列2支为阳性对照组，各加入0.1 mL的2.00 λ细菌内毒素标准对照溶液；1列2支为供试品组，各加入0.1 mL供试品溶液；1列2支为供试品阳性对照组，各加入0.1 mL含2.00 λ细菌内毒素的供试品溶液。37 ℃水槽保温60 min，取出并缓缓倒转180°，观察结果。7个批次的供试品均如上操作。2结果与分析2.1鲎试剂灵敏度复核试验结果（见表1）由表1可知，细菌内毒素2.00 λ浓度管均为阳性，0.25 λ浓度管均为阴性，阴性对照管全为阴性；结果表明，试验方法有效。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.004.T001表1鲎试剂灵敏度复核试验结果Tab.1Sensitivity check result of Tachypleus amebocyte lysate reagent项目平行管号12340.25 λ----0.50 λ-++-1.00 λ++++2.00 λ++++阴性对照--——反应终点浓度/λ1.000.500.501.00注 ：“+”表示阳性标记，“-”表示阴性标记；下表同。依据公式得鲎试剂灵敏度测定值λc=0.088 EU/mL，此测定值在0.50~2.00 λ（包括0.50和2.00 λ）范围内，符合规定，判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，以标示灵敏度0.125 EU/mL为该批次鲎试剂的灵敏度。2.2干扰试验结果（见表2）由表2可知，供试品溶液组和阴性对照组的所有平行管均为阴性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.004.T002表2干扰试验结果Tab.2Resut of interfere test组别2.00 λ1.00 λ0.50 λ0.25 λ反应终点浓度/λ细菌内毒素标准对照溶液1++--1.002+++-0.50含细菌内毒素的供试品溶液1+++-0.502++--1.003++--1.004++--1.00阴性对照--供试品溶液--依据公式得细菌内毒素标准对照溶液组的结果为0.088 EU/mL，干扰试验组的结果为0.105 EU/mL，结果均在0.50~2.00 λ（包括0.50和2.00 λ）范围内，符合要求；说明试验有效且供试品在稀释浓度为0.125 g/L时无干扰作用，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检测。2.3供试品细菌内毒素检查（见表3）由表3可知，阳性对照组均为阳性，阴性对照组均为阴性，供试品阳性对照组均为阳性，表明试验结果成立。两个厂家7个批次的供试品检测结果均为阴性，符合规定。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.004.T003表3供试品细菌内毒素检查结果Tab.3Bacterial endotoxin test result of samples厂家批号平行管号供试品供试品阳性对照阳性对照阴性对照判定艾美科健生物医药有限公司PS077-18020011-++-符合规定2-++-PS077-17120251-++-符合规定2-++-PS046-18020011-++-符合规定2-++-PS046-18020021-++-符合规定2-++-齐鲁晟华制药有限公司7110671182111-++-符合规定2-++-80671025A1-++-符合规定2-++-6050671050111-++-符合规定2-++-3讨论根据内毒素限值计算公式[8-9]L=K/M，参考美国药典标准中盐酸头孢噻呋的细菌内毒素限值以及同品种的原料与不同制剂间内毒素限值应基本一致的惯例，为保证安全用药，本试验取1.0 EU/mg作为盐酸头孢噻呋无菌原料的细菌内毒素限值[10-12]。细菌内毒素检查法要求试验供试品溶液的pH值控制在6.0~8.0范围内[13]；因此，供试品检测前经常需加入二价阳离子调节剂、碱性或酸性调节剂或采用稀释法消除供试品对鲎试剂的干扰[14-18]。由分子式可知，盐酸头孢噻呋在水中呈酸性，但不溶于水，经验证能够溶解于碳酸钠溶液、氢氧化钠溶液[19-20]。本试验选用2.6%无内毒素碳酸钠溶液作为溶剂，呈碱性；盐酸头孢噻呋初始浓度越低，终溶液pH值越高，越易对试验结果产生干扰，故需固定供试品初始溶液浓度，确保pH值在6.0~8.0范围内，必要时需调节pH值，以防干扰。内毒素检测存在许多局限性，不同的检查方法得出的检测结果之间差异很大，且脂多糖作为内毒素的主要成分，在其结构、溶解度等物理性质方面以及生物活性方面均存在较大的异质性；此外，内毒素检测结果可因所用检测试剂生产厂家及其生产批次的不同而出现差异。鲎试验属于生物试验，生物学检查缺乏化学检查的精确性；且随着对鲎保护力度的不断加大，急需研发鲎试验的替代方法[2,21-23]。4结论本研究中鲎试剂灵敏度复核试验和干扰试验结果均符合要求，应用建立的方法对供试品进行内毒素检查，结果符合规定且稳定。本试验结果表明，建立的细菌内毒素检查法（凝胶法）合理可行，可作为常规细菌内毒素检查法对盐酸头孢噻呋无菌原料进行质量监测。本试验为盐酸头孢噻呋无菌原料的安全性评价和质量控制提供了一定参考，对更好地控制盐酸头孢噻呋无菌制剂和注射剂的产品质量具有一定价值。