犬细小病毒病，又称犬传染性肠炎或犬病毒性肠炎，是一种由犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）感染所导致的烈性传染病，幼犬感染率和病死率较高[1]。该病可根据临床表现分为出血性肠炎型和急性心肌炎型[2-3]。CPV基因组包括NS1、NS2、VP1、VP2，其中VP2基因中最易发生突变，突变速度与RNA病毒相似，速率达到了2×10-4置换/位点/年[4]。CPV仅有一种抗原型，即CPV-2；但随着CPV的不断进化，截至2000年已报道发现了CPV的3种亚型。目前，已经出现的亚型包括CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c、CPV-2c（a）和CPV-2c（b）[5-7]。中国的主要流行株包括CPV-2a和CPV-2b，但近几年因297位氨基酸由Ser突变为Ala，而将其命名为New CPV-2a和New CPV-2b[8]。有研究者提出猜想，即免疫失败可能是由于不断出现的新型变异株，传统疫苗免疫对不同变异株的中和能力降低，导致临床上免疫疫苗后的犬感染CPV的情况时有发生[9-10]。本研究对1株CPV进行病毒滴度测定、病毒VP2基因测序鉴定以及VP2基因序列分析，了解荆州地区犬细小病毒的进化规律及当前的流行趋势，为该地区对犬细小病毒病的预防及治疗提供参考。1材料与方法1.1试剂与仪器主要试剂：猫肾细胞（F81）为华中农业大学动科动医学院曹罡教授馈赠；DMEM培养基、新生牛血清、0.25% Trypsin-EDTA（赛默飞世尔科技公司）；2×PCR Taq Mix、2×Pfu Mix（北京佳兰生物科技有限公司）；DL 2000 DNA Buffer（北京聚合美生物科技有限公司）；DNA胶回收试剂盒、病毒DNA提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司）。主要仪器：台式冷冻离心机（上海耐圣卡兰实业有限公司）；CO2培养箱、恒温培养箱（上海博讯实业有限公司）；PCR扩增仪（BIOMETRA）；紫外凝胶成像系统（上海培清科技有限公司）。1.2试验方法1.2.1样品采集于荆州某动物医院就诊的1只因剧烈腹泻、呕吐死亡的2月龄博美幼犬，经朝云帆干式荧光免疫分析仪检测CPV为阳性。无菌条件下采集患犬肠道组织及内容物，研磨后反复冻融3次，加入适量PBS溶液，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，加入终止浓度为10%的100 U/mL的双抗（青、链霉素）溶液，-80 ℃保存。1.2.2病毒分离与培养预先配制好含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基。将F81细胞在37 ℃、5% CO2的条件下进行培养，待细胞铺满单层后（24~48 h），对其进行传代。将处理好的病料样品按照1∶10细胞培养液的体积加入刚贴壁的F81细胞培养瓶中，37 ℃、5% CO2培养12 h后，换为2%犊牛血清浓度的DMEM培养液中培养，并设置1组不接毒的细胞作为对照组。细胞连续培养3~4 d，每日观察是否出现细胞病变（CPE）现象。细胞出现CPE现象并且程度达到80%以上时，将其在-20 ℃以及4 ℃条件下分别冻融3次，再将病毒进行连续传代培养。1.2.3病毒DNA提取将培养的第3代病毒液作为模板提取病毒DNA，提取步骤参照病毒DNA提取试剂盒说明书。1.2.4引物设计采用卜宾等[11]设计的CPV检测引物P1进行PCR检测。参照GenBank中上传的CPV的VP2蛋白基因的序列设计了一对用于扩增VP2基因全长的引物P2，添加BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切位点。引物由生工生物工程（武汉）股份有限公司合成，引物序列见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.001.T001表1引物序列Tab.1Primer sequence引物名称引物序列产物长度/bpP1F：5'-GAAGAGTGGTAAATAATT-3'682R：5'-CCTATATAACCAAAGTTAGTAC-3'P2F：5'-CGCGGATCCATGAGTGATGGAGCAGTTC-3'1 755R：5'-CCCAAGCTTTTAATATAATTTTCTAGGTG-3'1.2.5PCR鉴定以1.2.3中获得的病毒DNA作为模板，引物P1进行PCR鉴定。PCR反应体系（25 μL）：模板DNA 4 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×PCR Taq Mix 12.5 μL、ddH2O 6.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应结束后，取5 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.6病毒滴度（TCID50）的测定使用DMEM培养液作为稀释液对待测病毒液进行10倍系列稀释，按顺序转移至96孔细胞培养板中，每孔接种100 μL，取等量DMEM培养液作为空白对照。每孔加入100 μL的3×105个/mL细胞悬液。37 ℃ 5% CO2的条件下培养3~6 d，每日观察细胞CPE情况，按Reed-Muench两氏法计算待检病毒的TCID50值。1.2.7目的基因的PCR扩增以1.2.3中获得的病毒DNA作为模板，引物P2进行PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）：模板DNA 1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×PCR Taq Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应结束后，取5 μL PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.8PCR产物的回收参考DNA小量凝胶回收试剂盒说明书的方法，对上述反应产物进行纯化回收。回收后的DNA-20℃保存。1.2.9序列分析将1.2.7中回收的PCR产物送往生工生物工程（武汉）股份有限公司测序。使用DNAMAN软件对获得的测序结果进行拼接和分析，将得到的序列与GenBank中已收录的30株国内外的CPV VP2基因序列进行同源性比对，使用Mega 5.0软件构建系统进化树，分析氨基酸变异情况，确立新病毒株的分型。2结果与分析2.1病毒分离结果（见图1）由图1可知，将处理好的病毒上清同步接种F81细胞后，细胞出现拉网、皱缩（CPE）现象。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.001.F001图1病毒分离结果Fig. 1Result of virus isolation2.2病毒的PCR鉴定结果（见图2）由图2可知，以第3代犬细小病毒液的DNA为模板，进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳观察到1条大约682 bp的目的条带，符合预期的犬细小病毒的结果。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.001.F002图2病毒的PCR鉴定结果Fig. 2PCR result of virus注 ： M为DNA标准DL2000；1为分离株CPV-JZ2020；2为阴性对照；3为阳性对照。2.3病毒滴度测定结果按照Reed-Muench法计算，第5代的病毒TCID50滴度为105.0/mL。2.4VP2基因的PCR扩增（见图3）由图3可知，PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可观察到一条大约为1 755 bp的目的条带，符合预期的结果。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.001.F003图3VP2基因PCR扩增结果Fig. 3PCR amplification results result of VP2 gene注 ： M为DNA标准DL2000；1、2为VP2基因的PCR扩增产物；3为阳性对照。2.5VP2基因序列分析将得到的VP2基因命名为VP2-JZ1。经过分析发现，VP2-JZ1一共含有1 755个核苷酸，AT值所占有的比例是64.30%，而CG值所占有的比例是35.70%。其中A为616个，T为512个，C为278个，G为349个。通过VP2基因推导出的VP2蛋白包含584个氨基酸。申请GenBank登录号为MW495851。使用DNAMAN软件预测了VP2-JZ1蛋白的抗原肽段。结果显示，在247~256、145~156、479~493、495~505、135~143、267~276、531~542、453~466、103~114、66~72、170~178、285~296、80~86、421~434、335~346、569~581、558~565、398~403、126~131、217~222、4~9、195~202、207~213等23个位置可能存在抗原表位。2.6VP2基因的同源性分析（见表2、图4、图5）使用MEGA5.2软件对VP2-JZ1和GenBank中收录的VP2基因（见表2）进行比较显示。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.001.T002表230株参考株VP2信息Tab.2VP2 gene information of 30 reference strains登录号地点基因型登录号地点基因型DM381006.1荷兰疫苗株—MH155193.1甘肃CPV-2cEU659116.1经典疫苗株—MK517993.1河南CPV-2cEU914139.1美国疫苗株—MT488458.1广州CPV-2cMT029326.1长春CPVMK331997.1广西CPV-2cKR869670.1北京CPV-2aMK357727.1台湾CPV-2cMT488463.1广东CPVMN832850.1台湾CPV-2cMF001439.1江苏CPV-2aKR611522.1吉林CPV-2cMF177241.1乌拉圭CPV-2aKT162014.1吉林CPV-2cMH764262.1韩国CPV-2aMN810916.1吉林CPV-2cJQ268284.1甘肃CPV-2bLC216904.1日本CPV-2cJQ743892.1黑龙江CPV-2bMT106234.1泰国CPV-2cKX774250.1巴西CPV-2bMT106236.1泰国CPV-2cMT585712.1智利CPV-2bMK895487.1意大利CPV-2cMF001435.1江苏CPV-2cMK895490.1意大利CPV-2cMF467229.1河南CPV-2cMN451682.1美国CPV-2c由图4可知，VP2-JZ1株与30株来自不同国家的VP2基因的核苷酸同源性高达98.39%~99.83%；由图5可知，氨基酸同源性为97.56%~100.00%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.001.F004图4VP2基因核苷酸同源性分析Fig.4Nucleotide homology analysis of VP2 geneXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.001.F005图5VP2基因氨基酸同源性分析Fig.5Amino acid homology analysis of VP2 gene2.7VP2基因的遗传进化分析（见图6）由图6可知，VP2-JZ1株与CPV-2c型的病毒株亲缘性最近，属于同一分支；结果表明，VP2-JZ1株属于CPV-2c型；VP2-JZ1株与三大疫苗株遗传关系较远，而且与VP2-JZ1株同源性高的参考株也与疫苗株遗传关系较远。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.001.F006图6各地不同VP2基因遗传进化树Fig.6Different strains of VP2 gene phylogenetic tree3讨论CPV可在多种动物细胞内进行感染增殖。近年来，犬肾细胞（MDCK）和猫肾细胞（F81）细胞是最常用于分离培养CPV的两种细胞。有报道表明，F81细胞接种CPV后的CPE较MDCK细胞更明显。因此，本试验采用F81细胞分离培养病毒。犬粪便中成分较杂，有毒成分较多，可能会对接种的细胞产生毒性作用，进而严重影响细胞贴壁生长。在接种细胞前，要将病料经氯仿处理和微孔滤膜过滤除菌，去除病料中的细菌和有毒物质。本研究所采集的病料为CPV确诊死亡病犬的肠管及肠道内容物，病料经过处理后通过F81细胞分离培养病毒，在37 ℃ 5% CO2的培养条件下，接毒细胞在24~72 h出现了拉网、聚集、脱落等细胞病变现象，收取病毒液盲传5代后CPE现象仍明显。收集病毒液提取DNA对其进行PCR鉴定，结果显示，凝胶电泳鉴定有1条明显的条带，通过DNA测序最终确定该分离株为犬细小病毒，命名为CPV-JZ2020，第5代的病毒TCID50滴度为105.0/mL。在临床使用疫苗的过程中免疫失败的现象时有发生，是由于使用的疫苗仍旧是基于最开始发现的分离株制备而成[12-13]。Ｘ射线晶体学解析发现，CPV病毒衣壳由约由60个结构蛋白组成，其中最主要的衣壳蛋白为VP2蛋白，其形成的衣壳上的纤突是决定病毒的抗原特性和宿主范围的关键区域[14]，一旦VP2蛋白上的关键氨基酸位点发生改变，病毒的抗原性和致病性也会随之改变，进而出现新的变异型，部分变化甚至会导致病毒的感染对象增加[15]。CPV-2可能是由猫细小病毒（FPV）变异而来，随后由貂和狐狸等野生犬科动物逐渐传播至犬；经过几年的历程，CPV的抗原出现了变化，包括抗原性、血凝性以及感染的宿主种类等，其遗传变异性甚至与RNA病毒相似。随后，VP2蛋白的5个氨基酸发生了变化，出现了新的基因型CPV-2a。1984年，其主要抗原位点426位发生了突变（Asn→Asp），将其命名为CPV-2b，此种基因型一般会与CPV-2a发生混合感染。随后，426位氨基酸又出现了新的突变（Asn/Asp→Glu），命名为CPV-2c。通过测序结果可知，本研究所获得的CPV-JZ2020的VP2基因（VP2-JZ1）一共含有1 755个核苷酸，584个氨基酸，并申请了GenBank登录号，为MW495851。通过遗传进化分析发现，VP2-JZ1与CPV-2c型的病毒毒株亲缘性最近，属于同一分支，说明VP2-JZ1属于CPV-2c型。VP2-JZ1与30株来自不同国家的不同VP2基因的核苷酸同源性高达98.39%~99.83%，氨基酸同源性为97.56%~100.00%。通过基因比对发现，本研究分离的CPV-JZ2020株的VP2蛋白同所选取的国内外的CPV-2c型均发生了F267Y、S297A、Y324I、Q370R、N426E的突变，但CPV-JZ2020未出现部分病毒毒株发生的A5G的突变。VP2蛋白由4个无规则卷曲的Loop构成，病毒的抗原性质由该结构决定。第267位氨基酸不在任何Loop中，而本分离株的VP2蛋白发生突变的第297、300以及324位氨基酸均位于Loop3中，其顶部突起部位由第300~303位氨基酸组成。Loop4顶部突起部位则由第421~428位以及第433~443位氨基酸组成。有研究发现，VP2蛋白的GH环变异率最高，即氨基酸267~498位[16]，其中，亲水性和抗原指数较高的350~400位于B细胞抗原表位区，此为蛋白的潜在跨膜区[17]，VP2-JZ1的突变位点存在于此活跃区域中。虽然267位发生了变异，但由于该位点并未暴露于VP2蛋白表面，所以可能并不会对CPV的抗原性产生影响。但近年来有关F267Y的突变的报道逐渐增多，在本分离株中也出现了该突变，其影响有待进一步研究。297位点位于B细胞抗原表位附近，此位点的突变可能会引起CPV抗原性的变化，S297A的改变使CPV在CPV-2a与CPV-2b亚型的基础上被新命名为New CPV-2a与New CPV-2b亚型[18]。2004年，我国首次报道了Y324I的突变，且日、韩等其他亚洲地区也发现了该突变[19]。323位保守氨基酸已被证明是影响CPV感染宿主范围的关键点之一[20]，324位与其相邻，其突变可能会对323位点造成影响，故Y324I也有影响CPV感染宿主范围的可能[21]。324位突变位点与323位氨基酸相邻，这种突变可能导致其与犬转铁蛋白受体结合的能力发生改变。本研究所分离的CPV-2c中出现了Q370R突变，该突变为CPV-2c型的特有突变。该突变可能引起蛋白构象变化，导致CPV致病性出现不同程度的变化，Q370R突变也在CPV-2a的报道中出现过，而目前主要见于CPV-2c。N426E是CPV-2c的标志性变异。通过绘制系统进化树可知，国内外CPV-2c亚型呈现1个独立的分支，且目前国内外分离的CPV病毒毒株与市面上常见的疫苗株距离均较远，此原因可能造成了CPV疫苗的免疫失败。4结论本研究成功分离犬细小病毒CPV-JZ2020株，第5代的病毒TCID50滴度为105.0/mL，并成功克隆出1 755 bp的CPV-JZ2020 VP2基因片段（VP2-JZ1）；同源性和遗传进化分析的结果显示，VP2-JZ1属于CPV-2c型；VP2-JZ1与30株不同国家的不同VP2基因的核苷酸同源性高达98.39%~99.83%，氨基酸同源性为97.56%~100.00%。本研究为进一步研究犬细小病毒的变异提供参考。