车前草是我国一味传统中草药，具有利尿、消炎、清热解毒的功效。Dong等[1]研究发现，车前草的提取物可上调抗氧化相关基因改善过氧化氢诱导的细胞活力下降，具有抗氧化作用。车前草多糖（PLP）为车前草中经过一定方法提取纯化得到的可溶性多糖。PLP具有清除体内自由基以及增强小鼠巨噬细胞吞噬、分泌等功能[2-4]，可调节小鼠巨噬细胞自噬等多种生物学活性[5]；车前草粗多糖可部分逆转环磷酰胺的免疫抑制作用[6]。Yang等[7]报道，车前草籽提取物可显著改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂代谢。Li等[8]采用车前籽多糖灌胃小鼠后注射LPS造成肝脏炎症，结果发现，车前籽多糖可抑制一氧化氮，诱导一氧化氮合酶和环氧合酶-2的表达，并增加小鼠肝脏金属硫蛋白的生成，保护炎症性肝损伤。目前，对车前草多糖的研究多集中于其体内调控机制和细胞水平，在畜禽生产上的应用研究较少。本试验以PLP为研究对象，旨在探讨PLP对肉鸡免疫功能的影响，为其在家禽生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验选用1日龄健康大恒优质肉仔鸡公鸡400只，个体体重差异不超过5 g，随机分为4组，每组10个重复，每个重复10只。试验期为4 w。对照组（A组）肉仔鸡饲喂基础日粮，B组、C组和D组分别在基础日粮中添加2、4和6 g/kg的车前草多糖。7日龄和9日龄时，各组分别免疫新城疫和禽流感疫苗，分组及免疫程序见表1。基础日粮组成及营养水平见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.009.T001表1试验分组及新城疫和禽流感疫苗免疫程序Tab.1Grouping and immunization procedures for Newcastle disease and avian influenza vaccines组别PLP添加量/(g/kg)新城疫灭活苗禽流感病毒（H5N1+H7N9株）灭活疫苗A组（对照组）0颈部皮下注射胸部皮下注射B组2颈部皮下注射胸部皮下注射C组4颈部皮下注射胸部皮下注射D组6颈部皮下注射胸部皮下注射XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.009.T002表2基础日粮组成及营养水平Tab.2Composition and nutrition level of basal diet项目1~21日龄22~42日龄原料组成/%玉米54.6069.00豆粕26.8018.20棉籽粕3.504.50玉米蛋白粉3.503.50磷酸氢钙1.801.25石粉1.341.22大豆油1.001.00面粉6.000氯化钠0.300.34氯化胆碱0.080.10赖氨酸0.380.36蛋氨酸0.100.09预混料0.600.44合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.2012.27粗蛋白质/%19.5017.70钙/%1.030.82总磷/%0.680.55赖氨酸/%1.200.97蛋氨酸/%0.450.41注 ：1.预混料为每千克1~21日龄日粮提供：VA 8 000 IU、VD3 2 400 IU、VE 36 IU、VK3 2.76 mg、VB1 2.4 mg、VB2 7.2 mg、VB6 4 mg、VB12 28 μg、生物素0.2 mg、泛酸钙13.68 mg、叶酸1.6 mg、烟酸44 mg、铁174 mg、铜20 mg、锰138 mg、锌125 mg、碘0.4 mg、硒0.5 mg。2.预混料为每千克22~42日龄日粮提供：VA 7 600 IU、VD3 2 280 IU、VE 34.2 IU、VK3 2.622 mg、VB1 2.28 mg、VB2 6.84 mg、VB6 3.8 mg、VB12 26.6 μg、生物素0.19 mg、泛酸钙13 mg、叶酸1.52 mg、烟酸41.8 mg、铁174 mg、铜20 mg、锰138 mg、锌125 mg、碘0.4 mg、硒0.5 mg。3.营养水平均为计算值。1.2试验材料车前草多糖（批号：SN191230，斯诺特生物技术有限公司）。鸡新城疫、禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原（批号分别为20201229、2019009，均购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司）；禽流感病毒灭活疫苗、鸡新城疫疫苗（批号分别为210545400、200920712，均购自青岛易邦生物工程有限公司）。1.3试剂与设备主要试剂：鸡γ干扰素（IFN-γ）ELISA试剂盒、鸡肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒和鸡白细胞介素2（IL-2）ELISA试剂盒（批号均为20218030，购自江苏酶免实业有限公司）。苏木素染液、伊红染液（批号分别为CR2102133、CR2101094，均购自武汉塞维尔生物科技有限公司）。主要仪器：转轮式切片机（徕卡-2016）、JT-12S自动组织脱水机（武汉俊杰电子有限公司）、RS36型全自动染色机（常州派斯杰医疗设备有限公司）、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）、数字切片扫描仪[Pannoramic 250，3DHISTECH（Hungary）]等。1.4测定指标及方法1.4.1免疫器官指数从1周龄开始，每周测量各组试验鸡体重、法氏囊重、胸腺重和脾脏重，每组测量5只，连续测量至4周龄，计算免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官湿重/试验鸡体重（1）1.4.2新城疫疫苗和禽流感疫苗抗体效价3周龄末和4周龄末采集各组试验鸡外周血5份，分离血清，-20 ℃保存。新城疫和禽流感疫苗抗体效价采用血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）测定。1.4.3鸡血清中γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）浓度在第4周龄末，每组采集外周血5份，分离血清。采用ELISA试剂盒检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2的浓度，具体操作方法参照试剂盒说明书进行。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 25.0统计软件中进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1PLP对肉鸡免疫器官指数的影响（见表3~表5、图1~图3）由表3可知，与对照组（A组）相比，在3周龄时，添加6 g/kg PLP的D组肉鸡法氏囊指数极显著提高（P0.01）；4周龄时，添加4 g/kg PLP的C组肉鸡法氏囊指数显著提高（P0.05），添加6 g/kg PLP的D组肉鸡法氏囊指数极显著提高（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.009.T003表3PLP对肉鸡法氏囊指数的影响Tab.3Effect of PLP on bursa of fabricius of broilers组别1 w2 w3 w4 w对照组（A组）1.89±0.223.09±0.783.48±0.473.66±0.58B组2.15±0.563.14±0.654.37±0.773.75±0.57C组2.99±0.894.37±0.774.55±0.194.96±0.99*D组2.18±0.653.38±0.085.80±1.03**5.05±0.49**注 ：与对照组（A组）相比，*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）；下表同。由表4可知，与对照组（A组）相比，2周龄时，添加2、4 g/kg PLP的B、C组脾脏指数均显著降低（P0.05），其余周龄各组脾脏指数差异不显著（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.009.T004表4PLP对肉鸡脾脏指数的影响Tab.4Effect of PLP on spleen index of broilers组别1 w2 w3 w4 w对照组（A组）1.35±0.272.38±0.491.63±0.591.39±0.40B组1.47±0.181.23±0.35**1.55±0.571.80±0.70C组1.46±0.261.48±0.31**2.05±0.611.74±0.40D组1.35±0.321.89±0.461.71±0.611.74±0.59由表5可知，日粮添加PLP对肉鸡胸腺指数无显著影响（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.009.T005表5PLP对肉鸡胸腺指数的影响Tab.5Effect of PLP on thymus index of broilers组别1 w2 w3 w4 w对照组（A组）4.95±1.427.29±1.778.30±1.238.66±1.27B组5.62±0.867.63±1.157.39±1.018.41±1.45C组5.90±0.987.72±1.508.89±1.087.21±0.84D组6.63±0.787.59±1.397.58±2.348.53±1.64由图1~图3可知，各组法氏囊组织黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜结构完整，黏膜层形成大的皱襞突入腔内，被覆假复层柱状上皮细胞，固有层内髓质和皮质间较多的淋巴细胞和巨噬细胞等，未见细胞数量明显减少或增加，黏膜下层、肌层和外膜未见明显炎性细胞浸润和增生；胸腺组织被膜结缔组织完整，皮质与髓质区分界较清晰；胸腺无明显萎缩，小叶结构正常；脾脏组织被膜完整，被膜及脾小梁纤维结缔组织未见增生，白髓与红髓分界清晰，白髓脾小结无反应性增生，亦无萎缩。表明连续饲喂车前草多糖对鸡免疫器官无组织损伤，无毒性反应。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.009.F001图12周龄时各组法氏囊组织学观察结果Fig.1Histological observation of bursa of fabricius in each group at two weeks of ageXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.009.F002图23周龄时各组法氏囊组织学观察结果Fig.2Histological observation of bursa of fabricius in each group at three weeks of ageXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.009.F003图34周龄时各组法氏囊组织学观察结果Fig.3Histological observation of bursa of fabricius in each group at four weeks of age2.2PLP对肉鸡新城疫疫苗和禽流感疫苗抗体效价的影响（见表6）由表6可知，3周龄时，各组间新城疫抗体效价差异不显著（P0.05）；4周龄时，B组新城疫抗体效价极显著高于其他3组（P0.01），A组、C组、D组间新城疫抗体效价差异不显著（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.009.T006表6PLP对肉鸡新城疫疫苗和禽流感疫苗抗体效价的影响Tab.6Effect of PLP on Newcastle disease vaccine and H5N1 serotype vaccine of broilers组别新城疫禽流感H5N13 w4 w3 w4 w对照组（A组）4.80±1.306.60±1.146.33±0.585.60±0.55B组5.20±0.838.40±0.55**5.67±0.587.00±1.22**C组4.20±0.486.80±1.106.33±1.156.80±0.45*D组4.80±0.446.00±0.007.60±0.896.20±0.453周龄时，各组禽流感H5N1疫苗抗体效价差异不显著（P0.05）；4周龄时，B组禽流感H5N1疫苗抗体效价极显著高于A组（P0.01），C组禽流感H5N1疫苗抗体效价显著高于A组（P0.05）。2.3PLP对肉鸡血清细胞因子浓度的影响（见表7）由表7可知，在4周龄时，与对照组（A组）相比，C组和D组肉鸡血清IFN-γ含量极显著提高（P0.01）。B组肉鸡血清IL-2含量显著高于A组（P0.05），C组、D组肉鸡血清IL-2含量均极显著高于A组（P0.01）；且D组血清IL-2含量显著高于B组、C组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.009.T007表7PLP对肉鸡血清细胞因子浓度的影响Tab.7Effect of PLP on cytokine content of broilers组别INF-γTNF-αIL-2对照组（A组）39.72±4.0353.65±10.0697.39±38.99B组41.59±9.9645.75±9.40155.34±32.61*C组59.22±10.44**55.57±14.02175.80±44.02**D组56.08±9.57**47.22±13.03239.00±15.63**ng/L3讨论胸腺、法氏囊为鸡的中枢免疫器官，脾脏为鸡的外周免疫器官，三者的发育情况是鸡免疫功能强弱的直接体现，而免疫器官指数则是反映其发育的一项重要指标。研究表明，在日粮中添加中药多糖可提高肉鸡生长性能和免疫功能，如枸杞多糖、大蒜多糖、刺五加多糖等[9-11]。本研究中，免疫组织病理切片观察发现，PLP对肉鸡免疫器官无明显损伤作用；4 g/kg和6 g/kg的PLP可显著促进法氏囊发育，而PLP对胸腺和脾脏的发育无显著促进作用，可能与PLP的给药剂量、给药时间和给药方式有关。机体免疫功能包括固有免疫和获得性免疫，而体液免疫又是获得性免疫的重要表现。疫苗的抗体效价是该疫苗免疫效果的直接体现，抗体效价越高，动物群体抗感染能力和抗病能力越强，对该群体的保护力越高。有研究报道，多种多糖对疫苗抗体效价具有提高作用，如巴楚蘑菇多糖、参芪多糖、甘草多糖等可提高雏鸡新城疫抗体水平[12-14]，黄芪提取物可使免疫抑制鸡的新城疫和禽流感疫苗抗体效价升高[15]。PLP作为佐剂同新城疫疫苗共同免疫时，可提高雏鸡新城疫疫苗抗体效价[16]。本试验中选用的疫苗均为灭活油乳剂疫苗，进行一次免疫效果较差，油乳剂缓慢释放可持续刺激机体产生免疫应答。结果发现，添加2 g/kg的PLP可显著提高新城疫抗体水平，添加2 g/kg和4 g/kg的PLP可显著提高禽流感H5N1抗体水平，可能与车前草多糖在机体内激活的信号通路和作用靶标有关。细胞因子的分泌功能是细胞免疫的重要体现之一，细胞因子具有多种生物学功能，其在参与细胞的生长分化，促炎和抗炎以及调节机体免疫功能中扮演重要角色。INF-γ可诱导Th1细胞分化；IL-2能活化T细胞使其产生细胞因子，还能够刺激自然杀伤性T细胞（NK细胞）增殖，增强NK细胞的杀伤活性及产生细胞因子，促进B细胞增殖和抗体分泌等功能。张英楠等[17]研究发现，刺五加多糖对环磷酰胺致免疫抑制雏鸡血液中的IFN-γ、IL-2和TNF-α等8种细胞因子mRNA的转录具有提高作用。陈俊良等[18]报道，日粮中添加白术多糖可促进海南黄鸡细胞因子分泌。张恒瑞等[19]研究发现，大枣多糖可显著提高黄羽肉鸡血清中IFN-γ、IL-2和IL-10含量。本试验结果发现，4 g/kg和6 g/kg的PLP可显著提高肉鸡血清中INF-γ和IL-2含量，且其分泌量随车前草多糖剂量升高而升高。试验结果提示，PLP可促进肉鸡部分细胞因子分泌进而提高细胞免疫和体液免疫。Jiang等[20]报道，车前籽多糖可通过激活TOLL4-MAPK-NF-κB途径诱导树突细胞成熟，可能是车前草多糖促进肉鸡血清细胞因子分泌的原因，但其具体作用机制仍待研究。4结论日粮中添加车前草多糖可以促进肉鸡法氏囊的早期发育，提高新城疫和禽流感H5N1疫苗抗体水平，提升肉鸡血清部分细胞因子浓度，增强肉鸡免疫功能。