肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，K. pneumoniae）属肠杆菌科（Enterobaeteriaceae）、克雷伯菌属（Klebsiella），为革兰氏阴性短杆菌，是1种人畜共患病病原，也是引起多种动物患病的条件性致病菌，可引起肺炎、败血症、化脓性感染、支气管炎、尿路感染及脑膜炎等[1-3]。现有研究表明，菌毛是肺炎克雷伯菌的1种主要的毒力因子[4-5]。在感染过程中，细菌通过菌毛接近宿主黏膜表面或者吸附于宿主细胞，进而使机体致病[6]。肺炎克雷伯菌的菌毛可分为Ⅰ型和Ⅲ型菌毛[7]。Ⅰ型菌毛属于甘露糖敏感性（mannose-sensitive hemagglutination，MSHA）菌毛，即甘露糖存在时会阻断菌毛与红细胞的凝集现象，主要附着于尿道上皮细胞；Ⅲ型菌毛具有甘露糖抵抗血凝特性（mannose-resistant hemagglutination，MRHA），又称为甘露糖抵抗血凝特性菌毛，主要附着于呼吸道上皮细胞[8]。上述两种菌毛的主要结构亚单位基因为fimA和mrkA[9]。Ⅰ型菌毛由一组fim（B、E、A、I、C、D、F、G、H）基因群所表达，fimA是负责表达Ⅰ型菌毛柄的结构基因；Ⅲ型菌毛由一组mrk（E、A、B、C、D、F）基因群所表达，mrkA是负责表达Ⅲ型菌毛柄的结构基因。本研究对近年在重庆、四川部分肉牛场分离到的20株肺炎克雷伯菌进行了MSHA/MRHA试验，鉴定其菌毛类型，并对20株菌的fimA基因和mrkA基因进行了测序及氨基酸序列分析。研究旨在揭示川渝地区克雷伯菌菌毛类型与fimA基因和mrkA基因的变异特点，为深入研究其致病机制提供参考。1材料与方法1.1试验材料通过棉拭子的方法采集重庆、四川部分肉牛场的牛上呼吸道黏液，分离细菌；通过生化试验、16S rRNA鉴定出20株肺炎克雷伯菌，分别编号为K. pn 1~K. pn 20，其中K. pn 4、K. pn 11、K. pn 20分离自四川，其余分离自重庆。SPF豚鼠购自重庆市中药研究院。1.2试剂与培养基D-甘露糖（上海国药集团化学试剂有限公司）、DNA回收试剂盒（广州飞扬生化有限公司）、PCR试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）；小剂量DNA提取试剂盒、DL2000DNA Marker（生工生物工程（上海）有限公司）；改良Minka液体培养基、2%豚鼠红细胞悬液等。1.3主要仪器AR1140/C电子分析天平（上海奥豪斯公司）、LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械）、DYY-6C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、S10000PCR仪（Thermal Cycler）、TGL-16高速冷冻离心机等。1.4MSHA/MRHA试验按照参考文献[10]进行。将各菌株分别经改良Minka液体培养基37 ℃静置培养48 h，同样培养条件下连续传代3次，即为菌毛化菌体。菌毛化菌体制成约50亿CFU/mL细菌悬液，每株菌分为不加D-甘露糖和加D-甘露糖（终浓度为0.5%）的两个样本，加入等量2%豚鼠红细胞悬液，设生理盐水空白对照；振荡后4 ℃保存2 h，观察血球凝集反应和D-甘露糖是否抑制凝集。将甘露糖抵抗血凝试验阳性的菌株，4 ℃条件下完全凝集，37 ℃静置30 min，检查凝集现象是否被解脱。凝集解脱后，重新混匀4 ℃保存1.5 h，观察是否再现凝集反应。能够凝集豚鼠红细胞的菌株可判定MSHA反应阳性；若37 ℃出现解脱，4 ℃又重现凝集反应，可判定为MRHA反应阳性。1.5fimA和mrkA基因的PCR扩增、测序20株菌毛化菌体经麦康凯培养基培养后，核酸提取试剂盒提取其DNA，PCR扩增fimA和mrkA基因序列，引物序列见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.008.T001表1引物序列Tab.1Primer sequence引物序列（5'→3'）产物长度/bpⅠ型菌毛fimAF：ATTGAATTCATGAAAATCAAAACACTGGCAATGR：ATTCTCGAGTTACTCGTACTGCACTTTGAACGTG549Ⅲ型菌毛mrkAF：ATTGAATTCATGAAAAAGGTTCTTCTCTCTGCAGCR：ATTCTCGAGTTACTGGTAAGTAATTTCGTAAGTCGC609PCR反应体系（25 µL）：上游引物0.5 µL、下游引物0.5 µL、ddH2O 9.5 µL、DNA模板2 µL、2×mix DNA聚合酶预混液12.5 µL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min。Ⅰ型菌毛菌株的PCR反应体系与Ⅲ型相同，但反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，30个PCR循环；72 ℃ 10 min。反应结束后取5.0 µL PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。DNA回收试剂盒对目的片段进行回收与纯化，由上海生物工程有限公司测序。1.6序列分析测序结果利用MEGA软件与GenBank中登录的fimA和mrkA基因序列进行同源性比较，绘制系统进化树。同时将基因翻译成氨基酸序列，进行氨基酸序列分析。2结果与分析2.1肺炎克雷伯菌MSHA/MRHA试验结果（见图1）由图1可知，将20株菌毛化肺炎克雷伯菌进行MSHA/MRHA试验后，结果显示，有5株菌株不能抵抗D-甘露糖的抑制作用，其余均能够抵抗D-甘露糖的抑制作用，且在37 ℃下均可被解脱，在4 ℃下重现完全凝集，符合MRHA阳性判定标准，阴性对照组无自凝现象。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.008.F001图1肺炎克雷伯菌MSHA/MRHA试验结果Fig1MSHA/MRHA test result of K. pneumoniae注 ： a行为with D-mannose；b行为without D-mannose；c行为NS；1列为K. pn type 3 fimbriae；2、3列为K. pn type 1 fimbriae。上述结果表明，该20株肺炎克雷伯菌中产生Ⅰ型菌毛的有5株，为：K. pn 16~K. pn 20；产生Ⅲ型菌毛的有15株，为：K. pn 1~K. pn 15。2.2肺炎克雷伯菌基因的PCR鉴定（见图2、图3）由图2、图3可知，20株供试菌株中，有5株菌针对Ⅰ型菌毛主要结构亚单位基因（fimA）序列的引物扩增出549 bp的目的片段；15株菌针对Ⅲ型菌毛的主要结构亚单位基因（mrkA）序列的引物扩增出609 bp的目的片段，与预期的大小相符，且PCR鉴定结果的肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株和Ⅲ型菌毛菌株与MSHA/MRHA试验结果相符。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.008.F002图2肺炎克雷伯菌fimA基因的PCR鉴定Fig.2PCR identification of fimA gene of K. pneumoniae注：M为DL2000 DNA Marker；1~5为K. pn 16~K. pn 20。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.008.F003图3肺炎克雷伯菌mrkA基因的PCR鉴定Fig.3PCR identification of mrkA gene of K. pneumoniae注 ： M为DL2000 DNA Marker；1~15为K. pn 1~K. pn 15。2.3序列同源性及系统进化树分析（见图4）研究中的5株fimA基因和15株mrkA基因与GenBank中登录的fimA和mrkA基因序列进行同源性比较，并构建系统进化树。结果显示，fimA基因核苷酸序列的同源性为82.6%~98.9%，推导氨基酸序列同源性为90.9%~97.7%，mrkA基因核苷酸序列的同源性为80.7%~99.7%，推导氨基酸序列同源性84.1%~100%。5个fimA基因与代表株NZ_CP009461.1的核苷酸序列同源性为83.1%~99.0%，推导氨基酸序列同源性为90.3%~97.7%；15个mrkA基因与代表株AOGO01000023.1的核苷酸序列同源性80.7%~99.7%，推导氨基酸序列同源性为84.1%~100.0%。由图4可知，分离株菌毛类型有Ⅰ型和Ⅲ型，Ⅰ型菌毛共5株，Ⅲ型菌毛菌株居多（15株）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.008.F004图4肺炎克雷伯菌分离株的基因进化树Fig.4Gene evolutionary tree of K. pneumoniae isolatesⅢ型菌毛菌株可分为4个分支，其中6个分离株（K. pn 1~K. pn 6）与AOGO01000023.1株同属一个分支。2.4重庆、四川部分肉牛场的肺炎克雷伯菌氨基酸突变位点比对分析（见表2、表3）由表2可知，测序的5个fimA氨基酸序列（菌毛类型均为Ⅰ型）与代表株NZ_CP009461.1比较，可分为2个分支，K. pn 20与K. pn 19 为同一支，均仅在95位氨基酸位点存在特异性变异。K. pn 16、K. pn 17和K. pn 18存在12个氨基酸差异，K. pn 16和K. pn 17均在19、95、97、101、104、118、129、133、142、151、170位氨基酸位点存在特异性变异，K. pn 18在19、74、95、97、118、129、151、170氨基酸位点存在特异性差异，并在74位出现特有的变异。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.008.T002表2重庆、四川部分肉牛场的肺炎克雷伯菌fimA氨基酸突变位点比对分析Tab.2Comparative analysis of fimA amino acid mutation sites of Klebsiella pneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan菌株氨基酸残基位点19749597101104118129133142151170NZ_CP009461.1TATAISSNPSPIK. pn 16A-ASVTGSAGTTK. pn 17A-ASVTGSAGTTK. pn 18ASAS--GS--TTK. pn 19--A---------K. pn 20--A---------由表3可知，测序的15个mrkA氨基酸序列（菌毛类型均为Ⅲ型）与代表株AOGO01000023.1比较，存在多个位点存在差异，分离株两分支间有32个氨基酸存在差异。其中K. pn 3分离株在20位出现特有变异，K. pn 12分离株在17位出现特有变异，K. pn 10分离株在70、187位出现特有变异，K. pn 11分离株在132、181、185位出现特有变异，K. pn 15分离株在115、119、144、146、175位出现特有变异。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.008.T003表3重庆、四川部分肉牛场的肺炎克雷伯菌mrkA氨基酸突变位点比对分析Tab.3Comparative analysis of mrkA amino acid mutation sites of Klebsiella pneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan氨基酸残基位点AOGO01000023.1K. pn1K. pn2K. pn3K. pn4K. pn5K. pn6K. pn7K. pn8K. pn9K. pn 10K. pn 11K. pn 12K. pn 13K. pn 14K. pn 1517M-----------G---18T---------A-MM--20AAA--M------------21H---------NNNN--26T-N-N-NNNNNNNN--70A---------T-----72D---------NN----86N---------DDDDDD91D---------NN----93T-----N---DD----99S------TTT------115T--------------A116S---------TTAAAG117K---------EE----129Q--------------V128S-----------AAAA131Q---------KKKKK-132N----------D----141N---------SS---D144A--------------T146T--------------N续表3　重庆、四川部分肉牛场的肺炎克雷伯菌mrkA氨基酸突变位点比对分析XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.04.008.T004Tab.3（continue）　Comparative analysis of mrkA amino acid mutation sites of Klebsiella pneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan氨基酸残基位点AOGO01000023.1K. pn1K. pn2K. pn3K. pn4K. pn5K. pn6K. pn7K. pn8K. pn9K. pn 10K. pn 11K. pn 12K. pn 13K. pn 14K. pn 15147N-----------KKK-153D---------VV----160K-----------VVVT164S------AAATT----167A--------QQQQQQ175Y--------------F181S----------N----182A---------TTTTTT184T----------A---A185T----------S----187T---------S-----3讨论本研究通过MSHA/MRHA试验和PCR方法，鉴定出近年重庆、四川部分肉牛场的20株肺炎克雷伯菌的菌毛类型。其中有5株为Ⅰ型菌毛，占25%；15株为Ⅲ型菌毛，占75%。来自四川的3株菌株中的1株是Ⅰ型菌毛，2株是Ⅲ型菌毛。分离自重庆的17株，其中4株是Ⅰ型菌毛，占23.5%；13株属于Ⅲ型菌毛，占76.5%。本研究结果表明，重庆、四川肉牛所感染的肺炎克雷伯菌主要产Ⅲ型菌毛，进行肺炎克雷伯菌感染的防控应该更重视Ⅲ型菌毛。MSHA/MRHA试验法确定菌毛类型较烦琐、耗时。何礼洋等[11]、刘选梅等[12]报道，采用PCR方法可快速区分鉴别Ⅰ型、Ⅲ型菌毛肺炎克雷伯菌，与MSHA/MRHA试验相比更加敏感、快速、方便。本研究结果表明，运用PCR对菌毛进行分型，试验结果与MSHA/MRHA试验一致：MSHA/MRHA试验法鉴定出Ⅰ型菌毛的5株菌株均扩增出了约549 bp大小的特异片段，而MSHA/MRHA试验法鉴定出Ⅲ型菌毛的15株菌株均扩增出了约609 bp大小的特异片段。PCR法鉴定菌株菌毛类型可避免MSHA/MRHA试验的局限性，且更加快速、准确、方便。进化树是描述生物体形成或进化顺序的拓扑树结构，一般由一系列节点和分支组成，节点间的连线代表物种之间的亲缘关系[13]。为阐明fimA基因在各Ⅰ型菌毛菌株间及mrkA基因在各Ⅲ型菌毛菌株的进化关系，采用邻接法作进化树构建。本试验结果显示，15株Ⅲ型菌毛的菌株可以分成4个分支，说明各区县间的肺炎克雷伯菌菌毛类型进化关系存在差异。根据fimA和mrkA氨基酸序列比对结果显示，本研究菌株的fimA和mrkA氨基酸序列存在多处变异；与参考菌株比较，fimA中12处位点存在变异，marA中32处氨基酸位点存在变异。四川株的fimA氨基酸序列相对于重庆株变异较少，如菌株K. pn 20仅在95位氨基酸位点存在变异；重庆株除K. pn 19与K. pn 20相同，仅在95位氨基酸位点存在变异，其余分离株存在8~11个氨基酸存在差异。mrkA氨基酸序列的分离株有32个氨基酸存在差异，K. pn 1~K. pn 9氨基酸变异少，发生氨基酸变异位点0~3之间，其余6株菌氨基酸变异8~18个。氨基酸的变异不仅表示基因的多态性，还可能表示蛋白质的功能、菌株的致病性等特征发生变化。肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株aa95发生了氨基酸替代并由亲水性氨基酸变为疏水性氨基酸，K. pn 16和K. pn 17在aa19、aa118和aa142位点均由亲水性氨基酸变为疏水性氨基酸，K. pn 18在aa19和aa118由亲水性氨基酸变为疏水性氨基酸。Ⅰ型菌毛黏附作用的关键在于疏水能力的大小[14]，排斥水分子的能力增加时细菌菌毛的黏附能力更强，宿主机体更易致病。Ⅲ型菌毛的表达与细菌表面疏水性、致病性相关[15]，当菌毛主要亚单位组成的疏水性氨基酸的比例增高时，Ⅲ型菌毛可提高肺炎克雷伯菌表面疏水性。本研究中Ⅲ型菌毛菌株K. pn 11~K. pn 15中aa86、aa167、aa182均发生了氨基酸替代，mrkA氨基酸187个位点中28.13%的氨基酸由亲水性变为疏水性；因此，预测相应菌株的黏附能力可能增强，毒力更强。4结论MSHA/MRHA试验法对本研究的20株肺炎克雷伯菌敏感性不高。通过PCR方法，鉴定出20株肺炎克雷伯菌中有5株为Ⅰ型菌毛，15株为Ⅲ型菌毛，重庆、四川肉牛所感染的肺炎克雷伯菌主要产Ⅲ型菌毛，且各区县之间的肺炎克雷伯菌菌毛类型进化关系存在差异；分析fimA和mrkA氨基酸序列后发现，fimA中12处位点存在变异，mrkA中32处氨基酸位点存在变异，肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株aa95发生了氨基酸替代并由亲水性氨基酸变为了疏水性氨基酸，Ⅲ型菌毛菌株K. pn 7、K. pn 8和K. pn 9在164位氨基酸上均发生了S164A。因此，预测相应菌株的黏附能力可能增强，毒力更强。