甲壳素是在甲壳类动物外壳及真菌细胞壁中广泛存在的生物大分子多糖，自然界中产量仅次于纤维素[1]。甲壳素具有高度不溶性，限制其在各领域中的应用。壳聚糖是甲壳素脱乙酰度大于55%时得到的产物[2]，具有生物降解性、生物相容性、抗菌等功能[3]。壳聚糖对鱼类和甲壳类具有免疫调节作用[4]。氨基葡萄糖是壳聚糖的单体、甲壳素的最终水解产物，衍生物具有较好的抗菌抗炎活性、调节免疫、抑制肿瘤等作用[5]。水产养殖具有巨大的增长潜力[6]。均衡的养殖饲料不仅需要有蛋白质、碳水化合物等必需营养素，还需要补充微量元素和矿物质[7]。微量元素对动物体的生长至关重要[8]，其中硒是水产动物生长所必需的微量元素。硒纳米颗粒对鱼类生长具有促进作用，可以增强鱼的抗氧化状态[9]。适量膳食补充羟基蛋氨酸硒可提高南美白对虾的生长性能、抗氧化能力及亚硝酸盐耐受力[10]。已有研究将硒化合物和壳聚糖结合，提高硒的有效吸收[11]。肖玲等[12]发明了一种壳聚糖亚硒酸盐的制备方法，产品易被吸收，广泛在医药保健、农牧业等领域应用。但尚未见氨基葡萄糖硒在养殖中的研究报道。南美白对虾为十足目、对虾科、对虾属[13]，具有个体大、生长快、抗病力强等优点[14]，在海水虾养殖中占很大比例，具有很高的商业价值[15]。选择合适的饲料添加剂对虾的生长、提高对虾的产量有利[16]。若饲料添加剂选择不当，可造成对虾生长缓慢，产量下降甚至大量死亡[17-18]。目前，氨基葡萄糖硒在南美白对虾养殖领域的应用报道较少。本文探究氨基葡萄糖硒作为饲料添加剂对南美白对虾生长、品质、肠道菌群多样性等方面的影响，为南美白对虾的绿色健康养殖提供参考。1材料与方法1.1试验材料南美白对虾由山东省海阳市大碱厂养殖区提供。氨基葡萄糖盐酸盐（上海麦克林生化科技有限公司）、亚硒酸钠（国药集团化学试剂有限公司）、甲醇钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。1.2氨基葡萄糖硒的制备方法氨基葡萄糖硒的制备方法参考梁双林[19]。称取12.5 g甲醇钠，溶于50 mL无水甲醇；称取15 g亚硒酸钠溶于50 mL无水甲醇；称取50 g氨基葡萄糖盐酸盐溶于300 mL甲醇，加入甲醇钠溶液，搅拌2 min，抽滤得到母液；母液中加入亚硒酸钠溶液，50 ℃反应2 h，冷却至常温，冷冻过夜；抽滤冷冻后的溶液，滤饼50 ℃烘干，研磨得到氨基葡萄糖硒20 g。1.3试验设计与饲养管理试验在山东省海阳市大碱厂养殖区进行。养殖池体积为56 m3，水温（27±3）℃，pH值（7.4±0.2）。每日换水4次（平均6 h/次），24 h不间断充氧，保持微流水。每个养殖池的南美白对虾数量为1.8万只（所用的南美白对虾为两个月的虾苗），共21.6万只。试验分为对照组（不加氨基葡萄糖硒）与0.1%、0.5%、1.0%氨基葡萄糖硒添加组。1个养殖池为1个重复，每组分别3个重复。每日拌料投喂对虾2次，所用饲料为斑节对虾1号（福星生物有限公司）。试验开始前分别随机采样测量每组对虾的体长与体重，此后每周期测量1次，共3周。1.4样品采集养殖试验结束，每个养殖池中分别随机采集30只对虾，采用游标卡尺测量各组对虾的体长，电子分析天平称量对虾的体重，电感耦合等离子体质谱仪（日本岛津ICP-MS20230）检测南美白对虾的硒含量，氨基酸分析仪（德国赛卡姆S7130）分别测定各组的氨基酸含量。无菌操作条件下解剖取出完整肠道，送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序分析。1.5测定指标及方法采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）检测南美白对虾的硒含量，参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》。采用氨基酸分析仪分别测定各组的氨基酸含量，参考GB 5009.93—2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》。检测氨基酸含量之前样品的制备参考姜慧娴等[20]方法。通过测序平台对不同组南美白对虾的肠道菌群组成进行分析比较。养殖结束每组随机选取20只对虾，10只作为1个平行，每组各2个平行。样品进行肠道菌群检测前进行预处理。采取液氮研磨法将样品磨成粉末状，放入2 mL离心管，加入适量钢珠和裂解液，破碎仪破碎，提取。1.6数据统计与分析数据采用SPSS 16.0分析处理，Tukey's检验显著性。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示显著性差异。2结果与分析2.1氨基葡萄糖硒的制备与鉴定（见图1）由图1可知，m/z 406.8279的峰是氨基葡萄糖硒的质谱信号，说明氨基葡萄糖硒得到成功制备。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.014.F001图1氨基葡萄糖硒的制备与鉴定2.2氨基葡萄糖硒对南美白对虾生长的影响（见图2~图3）由图2可知，试验开始各组的体长并无显著差异，第1周内，与对照组相比，其他组的对虾生长较快，体长值均显著高于对照组（P0.05）。第3周养殖结束后，1%组对虾的体长值最大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.014.F002图2氨基葡萄糖硒对南美白对虾体长的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。由图3可知，试验第2、3周内，1%组对虾的体重值显著高于对照组（P0.05）。第3周养殖结束后，1%组对虾的体重值最大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.014.F003图3氨基葡萄糖硒对南美白对虾体重的影响2.3氨基葡萄糖硒对南美白对虾硒含量的影响（见图4）由图4可知，各氨基葡萄糖硒添加组硒含量均显著高于对照组（P0.05），1.0%氨基葡萄糖硒添加组硒含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.014.F004图4氨基葡萄糖硒对南美白对虾硒含量的影响2.4氨基葡萄糖硒对南美白对虾提高氨基酸含量的影响（见表1）由表1可知，各组含量最高的氨基酸均为谷氨酸，其次为天冬氨酸。0.1%组所含的氨基酸总量和必需氨基酸总量最高，均高于其他组。各组的鲜味氨基酸总含量有所差异，0.1%组的鲜味氨基酸总含量最高，其次是1%组。与对照组相比，其他组的蛋氨酸含量显著增加（P0.05）。此外，0.1%组的蛋氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量均最高。表明一定浓度的氨基葡萄糖硒可以增强风味。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.014.T001表1各组的氨基酸含量项目对照组0.1%组0.5%组1.0%组苏氨酸A/(g/100 g）0.63±0.030.69±0.030.61±0.010.68±0.02异亮氨酸A/(g/100 g)0.68±0.020.75±0.020.65±0.020.71±0.02亮氨酸A/(g/100 g)1.31±0.021.45±0.041.25±0.031.39±0.04缬氨酸A/(g/100 g)0.73±0.030.79±0.040.72±0.010.75±0.02苯丙氨酸A/(g/100 g)0.73±0.010.80±0.040.71±0.020.73±0.03赖氨酸A/(g/100 g)1.51±0.051.66±0.061.48±0.071.64±0.03组氨酸/(g/100 g)0.36±0.010.40±0.010.35±0.010.41±0.01精氨酸/(g/100 g)1.22±0.041.37±0.011.24±0.031.33±0.03谷氨酸B/(g/100 g)2.55±0.07a3.11±0.11b2.72±0.07a3.04±0.06b天冬氨酸B/(g/100 g)1.59±0.07a1.73±0.04b1.52±0.03a1.71±0.03b甘氨酸B/(g/100 g)1.32±0.071.40±0.051.30±0.031.36±0.11丙氨酸B/(g/100 g)1.12±0.051.22±0.011.11±0.021.17±0.01丝氨酸/(g/100 g）0.67±0.030.79±0.030.71±0.000.78±0.03脯氨酸/(g/100 g）0.66±0.010.77±0.020.72±0.010.75±0.03蛋氨酸B/(g/100 g）0.28±0.01a0.47±0.02c0.44±0.02bc0.42±0.03b酪氨酸/(g/100 g)0.57±0.020.64±0.010.55±0.020.56±0.02氨基酸总量/(g/100 g)15.92±0.5418.03±0.5416.08±0.4017.44±0.52必需氨基酸/(g/100 g)5.87±0.176.61±0.255.85±0.186.32±0.19非必需氨基酸/(g/100 g)10.05±0.3711.42±0.2910.23±0.2211.11±0.33鲜味氨基酸/(g/100 g)6.58±0.267.45±0.216.66±0.137.28±0.21必需氨基酸总量/氨基酸总量/%36.8736.6636.3836.24必需氨基酸总量/非必需氨基酸总量/%58.4157.8857.1856.89鲜味氨基酸总量/氨基酸总量/%41.3341.3241.4241.74注：1.A为必需氨基酸，B为鲜味氨基酸。2.同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.5氨基葡萄糖硒对南美白对虾肠道菌群的影响2.5.1不同处理组南美白对虾肠道菌群α多样性指数（见表2、图5）α多样性用于分析样品的微生物群落多样性。Shannon指数、Chao1指数和ACE指数越大表明菌群多样性越强，样品物种越丰富[21]。由表2可知，不同浓度处理组南美白对虾肠道菌群的物种数目、Chao1指数、ACE指数均显著高于对照组（P0.05）。Simpson可以估算样品中微生物多样性指数，Simpson指数值越大，说明群落多样性越低。不同处理组南美白对虾的肠道菌群Simpson指数均低于对照组。表明氨基葡萄糖硒处理组的群落多样性均高于对照组。本试验中各组样本覆盖指数均大于0.99，说明样本中序列没有被测出的概率极低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.014.T002表2不同处理组南美白对虾肠道菌群α多样性指数项目对照组0.1%组0.5%组1.0%组物种数目1 091a1 509b1 488b1 501bShannon指数5.2925.4645.4575.395Simpson指数0.0140.0120.0130.013Chao1指数1 359.213a1 703.557b1 674.696b1 691.574bACE指数1 253.291a1 675.478b1 668.863b1 672.898bShannoneven指数0.7440.7530.7470.750Coverage指数0.9930.9960.9940.995由图5可知，各组稀释曲线在序列数为40 000条后趋向平坦，表明此次测序数据量合理，测序深度已基本覆盖样品中所有细菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.014.F005图5不同处理组南美白对虾肠道菌群稀释曲线注：A1、A2为空白对照组；B1、B2为0.1%组；C1、C2为0.5%组；D1、D2为1%组；下图同。2.5.2不同处理组南美白对虾肠道菌群样本聚类树与柱状组合图（见图6）由图6可知，左侧为样本的相似性树状图，样本间差异越小，样本便会处在相近的同一个分支，样本颜色按分组信息区分。右侧为样本的相似性柱状图，展示各样本中的物种分布。由树状图可知，对照组和不同浓度处理组不在同一个分支，表明几组样品之间差异显著。由相对丰度图可知，对照组南美白对虾肠道norank_Acidobacteria_Gp4菌属、Sphingobacteriales菌属、Burkholderiales菌属、Rhodobacterales菌属的相对丰度分别为0.41%、1.09%、2.69%、1.46%；0.1%组4种菌群的相对丰度分别为9.59%、10.93%、5.70%、2.71%；0.5%浓度组4种菌群的相对丰度分别为7.28%、10.42%、6.34%、2.60%；1.0%组4种菌群的相对丰度分别为23.67%、6.36%、2.79%、2.54%。不同浓度处理组肠道norank_Acidobacteria_Gp4、Sphingobacteriales菌属、Burkholderiales菌属、Rhodobacterales菌属的相对丰度均高于对照组。表明不同浓度处理组提高南美白对虾几种主要菌群含量。对照组、0.1%浓度组、0.5%浓度组、1%浓度组unclassified_Bacteria菌属的相对丰度分别为11.71%、19.37%、19.56%、9.03%，0.50%浓度组unclassified_Bacteria菌属的相对丰度与其他组相比最大，其次是0.1%浓度组。对照组、0.1%浓度组、0.5%浓度组、1%浓度组unclassified_Betaproteobacteria菌属的相对丰度分别为3.32%、5.37%、4.94%、1.67%。0.1%浓度组该菌属的相对丰度与其他组相比最大，其次是0.5%浓度组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.014.F006图6不同处理组南美白对虾肠道菌群样本聚类树与柱状图2.5.3不同处理组南美白对虾肠道菌群样本相关性热图（见图7）由图7可知，对照组和不同氨基葡萄糖硒浓度组之间的相关性指数均明显降低，且氨基葡萄糖硒浓度越高，相关性指数越低。对照组和0.1%组之间相关性指数最低，差异最大。研究表明，不同浓度的氨基葡萄糖硒组和对照组具有较低的相关性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.014.F007图7不同处理组南美白对虾肠道菌群样本相关性热图2.5.4不同处理组南美白对虾肠道菌群功能β多样性分析（见图8）由图8可知，对照组和不同浓度氨基葡萄糖硒组之间点的分布都比较集中。对照组和不同浓度氨基葡萄糖硒组之间相距甚远且区分鲜明，表明不同浓度氨基葡萄糖硒组和对照组之间的物种相似度较低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.014.F008图8不同处理组南美白对虾肠道菌群功能β多样性分析3讨论3.1氨基葡萄糖硒对南美白对虾生长的影响体长是正确评估身体发育特征的指标，是评价生长速度的根据。通过养殖前后以及养殖期间对各组南美白对虾体长的测量，评估氨基葡萄糖硒对南美白对虾是否促生长。研究表明，硒对动物的生长发育、繁殖、免疫等具有重要作用[22]。动物体内的硒会影响脂肪、蛋白质及糖的代谢，促进动物体内生长激素的合成与分泌，加快蛋白质合成，促进生长[23]，可能是硒具有促生长作用的主要原因。硒元素在水产动物中的应用也十分广泛。在鱼日粮中添加有机硒，可以有效提高鱼的生长速度，降低幼鱼的死亡率[24]。在饲料中添加硒可以提高罗非鱼幼鱼的生长及提高肠道的酶活性[25]。在饲粮中适当提高硒水平可促进浅色黄姑鱼的生长[26]。氨基葡萄糖在调节机体的免疫力、参与营养物质代谢中具有重要的作用，有效提高机体的抗氧化功能，对畜禽的生长发育具有促进作用[27]。本研究中，与其他组相比，对照组在每个养殖周期内南美白对虾的体长和体重值均最低，不同浓度的氨基葡萄糖硒添加组南美白对虾的体长体重均有不同程度的提高，说明氨基葡萄糖硒配合饲料在南美白对虾养殖方面具有促进生长的功效。3.2氨基葡萄糖硒对南美白对虾硒含量的影响在部分畜禽养殖的研究中，添加硒可以提高动物的硒含量。王海宏等[28]在肉鸡饲料中添加硒后发现，添加硒组肉鸡的硒含量显著高于未添加硒的对照组。张乙山等[29]在生长肥育猪饲料中添加不同水平的纳米硒、酵母硒和亚硒酸钠发现，猪肝脏和肾脏的硒含量要显著高于对照组。研究以氨基葡萄糖为载体，与硒元素络合，使水产动物更容易吸收氨基葡萄糖和硒元素，达到提升畜禽及水产动物的抗病能力，提高肉制品口感和品质[30]。本研究中，与对照组相比，其他组的南美白对虾含硒量均有显著提高。因此，氨基葡萄糖硒配合饲料可以提高南美白对虾的含硒量。3.3氨基葡萄糖硒对南美白对虾氨基酸含量的影响氨基酸的组成与含量是评价蛋白质质量的重要指标。养殖结束分别检测各组的氨基酸含量。蛋白质的鲜美程度取决于天冬氨酸和谷氨酸两种鲜味氨基酸的相对比例和含量[31]。组氨酸可以增强风味，蛋氨酸可以增强回味，使口感更加丰富[32]。本试验中，与其他组相比，1%组的组氨酸含量最高，而0.1%组的蛋氨酸含量最高。呈甘味的特征氨基酸为甘氨酸和丙氨酸，从而使南美白对虾表现出明显的海产虾类的鲜美品质[33]。本研究中，0.1%氨基葡萄糖硒添加组的甘氨酸和丙氨酸的含量均最高，表明一定浓度的氨基葡萄糖硒可以增强风味；各组的氨基酸含量和比例有所差异，0.1%氨基葡萄糖硒添加组对虾的氨基酸的含量影响较大，氨基酸总量、必需氨基酸总量、鲜味氨基酸总含量均最高，出现差异的原因可能是虾本身的吸收和代谢能力不同所致，0.1%氨基葡萄糖硒饲喂后，南美白对虾对氨基葡萄糖硒的吸收效率可能高于其他组。因此，一定浓度的氨基葡萄糖硒可以提高南美白对虾的氨基酸含量，提升对虾的养殖品质。3.4氨基葡萄糖硒对南美白对虾肠道菌群的影响长期自然进化中，宿主与微生物形成复杂又稳定的共生关系。宿主为肠道菌群提供生存环境，肠道微生物在维持宿主肠道结构和功能、促进营养代谢、调节免疫系统等方面发挥着重要的作用[34]。不同浓度处理组南美白对虾肠道菌群的物种数目、Chao1指数、ACE指数均显著高于对照组。菌群相对丰度结果显示，不同浓度处理组的南美白对虾，几种主要肠道菌群的相对丰度均显著高于对照组。表明一定浓度的氨基葡萄糖硒能够提高南美白对虾肠道菌群的含量。本试验中，相似性树状图、样本相关性热图以及肠道菌群功能PCA图结果表明，不同浓度处理组和对照组之间均具有较低的相关性。究其原因，主要是经过不同浓度氨基葡萄糖硒饲喂后，南美白对虾的肠道菌群结构和组成发生改变。不同浓度氨基葡萄糖硒对南美白对虾的肠道菌群产生影响，一定浓度的氨基葡萄糖硒添加剂能够明显提高南美白对虾肠道菌群的多样性水平。4结论一定浓度的氨基葡萄糖硒可以促进南美白对虾的生长，提高南美白对虾的硒含量和氨基酸含量，改善肠道菌群的多样性，从而提升南美白对虾的养殖品质。氨基葡萄糖硒可作为高端饲料添加剂应用于南美白对虾的养殖领域。关于氨基葡萄糖硒的作用效果机制以及氨基葡萄糖硒在其他水产养殖领域的应用有待今后深入研究。