中草药具有增强动物机体免疫力，发挥防病、治病的功效[1-2]，能够促进动物生长、繁殖及提升畜禽类产品品质[3-5]，在饲料添加剂开发及其他饲用产品中得到广泛的应用。与传统抗生素相比，中药饲料添加剂具有活性成分多样、动物体内残留少及抗药性低等特点[6]。在畜禽类动物疾病的预防保健和治疗方面能够发挥综合调理和预防疾病的功能[7-8]，在提高或改善畜禽产品品质方面具有明显优势[3]。目前，中草药类饲料添加剂成为提升畜禽类养殖产品品质的重要方式[9-11]。复方黄芪饲料添加剂（Astragalus granule，AG）由黄芪、甘草、白茅根、茜草、紫草等药物组成[12-13]。黄芪、甘草具有益气补脾、提高免疫力的功效，能够应用于治疗脾虚或气血不足引起的正气不足所致畜禽发热[14-15]。白茅根、茜草、紫草属于清热解毒、凉血止血的药品，能够对畜禽之邪直入血分所致发热、疫病传播等进行有效预防和治疗[16-18]。本研究前期发现，AG具有促进肉鸡生长、提高免疫力、改善鸡肉品质等作用[19-20]。指纹图谱、多指标成分测定结果表明，毛蕊异黄酮苷、甘草苷、刺芒柄花苷等是重要黄酮类效用成分[21-22]。本试验通过薄层色谱对AG组成药物进行定性鉴别，采用紫外分光光度法对总黄酮含量进行定量分析，建立AG的质量控制方法，为质量控制提供参考。1材料与方法1.1仪器与试药1.1.1仪器与设备16.9403F 013-02紫外仪（北京六一生物科技有限公司）；HANGPING FA2104型天平（上海精科实业有限公司）；AB135-S电子天平（瑞士METTLER公司）；SB-5200 DTDN 超声波清洗器（宁波新艺生物科技股份有限公司）；HWM-1000数显恒温电热套（江苏杰瑞尔电器有限公司）；HH-2-39962数显恒温水浴锅（金坛杰瑞尔电器有限公司）；YOKO-XR薄层显色加热器（武汉药科新技术开发有限公司）；GZX-9076 MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。1.1.2材料与试剂芦丁（100080-201202）购自中国食品药品检定研究院。不同批次黄芪（实验室自制：20200601、20200602、20200603）。黄芪对照药材（蒙古黄芪：121430-201705）、甘草对照药材（胀果甘草：121049-201705）、白茅根对照药材（121145-201504）、茜草对照药材（121303-201704）、紫草对照药材（120974-201612）均购自中国食品药品检定研究院；硅胶G薄层色谱板（10 cm×10 cm，20181211）购自青岛海洋化工厂。试剂：甲醇（20180619）、乙醇（20180911）、三氯甲烷（20191025）、硫酸（20180510）购自天津市进丰化工有限公司；正丁醇（20180728）、乙酸乙酯（20180429）购自天津市光复科技发展有限公司；二氯甲烷（20190210）购自天津市北方天医化学试剂厂；丙酮（20190415）购自天津市森昌工贸有限公司；石油醚（20140417）、甲酸（20180401）、冰醋酸（20190503）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠（20200602）购自辛集市化工实验厂；硝酸铝（20170603）购自天津市科密欧化学试剂有限公司，亚硝酸钠（20160806）购自天津市光复科技发展有限公司。1.2测定指标及方法1.2.1黄芪的薄层色谱（TLC）鉴别精密称取AG细粉1.000 0 g，30 mL乙醇回流提取20 min，静置过滤，残渣加15 mL浓度为0.3%的NaOH溶液充分溶解过滤，使用稀盐酸试液调节滤液pH值至5~6，使用15 mL乙酸乙酯分离萃取，收集乙酸乙酯萃取液，无水硫酸钠脱水，过滤，滤液蒸干加1 mL乙酸乙酯溶解，得供试品溶液。取黄芪对照药材2.000 0 g，精密称定，同法制备黄芪对照药材溶液。取阴性对照药材（白茅根2.000 0 g、茜草0.500 0 g、紫草1.000 0 g、甘草0.666 6 g），同法制备黄芪阴性对照溶液。将上述样品溶液分别点于同一硅胶G薄层板，各样品溶液点样量均为10 μL，在三氯甲烷-甲醇（10∶1）中进行展开，取出、晾干，使用氨蒸气熏蒸显色，紫外灯（365 nm）检视。1.2.2甘草的薄层色谱鉴别称取4.0 g AG细粉，加20 mL甲醇超声20 min，提取液过滤，水浴蒸干，加30 mL水复溶，以水饱和的正丁醇振摇萃取2次，每次20 mL，合并上层正丁醇萃取液，40 mL水分2次进行洗涤，将水溶液弃去，回收剩余正丁醇液至干，加甲醇溶解至2 mL，即得供试品溶液。精密称取1.0 g甘草对照药材，同法制备甘草对照药材溶液。取阴性对照药材（黄芪3.0 g、白茅根3.0 g、茜草1.5 g、紫草1.2 g），同法制备甘草阴性对照溶液。将上述样品溶液分别点于同一硅胶G薄层板，各样品溶液点样量均为10 μL，在乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）中展开，取出，晾干，以10%硫酸乙醇显色，105 ℃加热使TLC斑点清晰，日光及紫外（365 nm）下检视。1.2.3白茅根的薄层色谱鉴别精密称取AG细粉2.000 0 g于具塞锥形瓶中，20 mL乙酸乙酯超声250 W 40 kHz处理10 min，将提取液过滤后，自然挥干，残渣加1 mL乙酸乙酯溶解，即得供试品溶液。取0.5 g白茅根对照药材，同上述方法制备白茅根对照药材溶液。取阴性对照药材（黄芪0.500 0 g、茜草0.200 0 g、紫草0.250 0 g、甘草0.166 7 g），置于圆底烧瓶中，10倍量水回流提取30 min。将提取的过滤液水浴蒸干，溶于1 mL水中，加入10 mL的95%乙醇醇沉，离心，取上清液，即得白茅根阴性对照溶液。将上述样品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，各样品溶液点样量均为10 μL，在二氯甲烷-乙酸乙酯（10∶1）中展开，取出，晾干，使用适量10%硫酸乙醇溶液显色，105 ℃加热使TLC斑点清晰，日光及紫外（365 nm）下检视。1.2.4茜草的薄层色谱鉴别精密称取AG细粉0.500 0 g，加入10 mL甲醇超声处理30 min，将提取液过滤，浓缩至1 mL。0.500 0 g茜草对照药材，同上制备茜草对照药材溶液。取阴性对照药材（黄芪1.000 0 g、白茅根1.000 0 g、紫草0.400 0 g、甘草0.333 3 g），同上制备茜草阴性对照溶液。将上述样品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液分别点样15、10、15 μL，在石油醚（60~90 ℃）-丙酮（4.0∶1.5）中展开，取出、晾干，紫外（365 nm）下检视。1.2.5浸出物测定参照2020版《中国药典》四部通则中的浸出物测定法（2201），精密称取AG细粉3 g于圆底烧瓶中，加入50 mL浓度为95%的乙醇，密塞，称重，静置1 h，回流提取1 h，冷却，取下圆底烧瓶，密塞，复称重量，使用95%乙醇补足失重，摇匀，过滤，取续滤液25 mL置于干燥至恒重的蒸发皿，水浴蒸干，105 ℃下干燥3 h，干燥器中冷却30 min，称重，计算AG中醇溶性浸出物含量（%）。对供试品中水溶性浸出物含量（%）进行测定。浸出物含量=浸出物重量×2/样品取样量×100%(1)1.2.6总黄酮含量1.2.6.1溶液的制备及检测波长的选择精密称取61.12 mg芦丁对照品于25 mL容量瓶中，加50%甲醇进行溶解，定容至刻度，即得芦丁对照品溶液。精密称取AG细粉0.50 g于10 mL容量瓶，50%甲醇定容至刻度，250 W 40 kHz超声处理10 min，静置过滤，取滤液，即得供试品溶液。精密量取0.4 mL供试品溶液和0.2 mL芦丁对照品溶液，分别置于5 mL容量瓶，依次加入0.2 mL 5% NaNO2，静置6 min，加入0.2 mL 10% Al(NO3)3，静置6 min，加入2 mL 4% NaOH，静置15 min，以50%甲醇定容至刻度。以不含供试品和对照品的显色体系溶液为空白，在200~800 nm范围内扫描对照品与供试品溶液。1.2.6.2线性关系的考察精密量取1.2.6.1项对照品溶液适量，使用50%甲醇分别稀释为2.44、1.63、1.22、0.61、0.31、0.15 g/L的6个不同浓度对照品溶液。精密吸取上述溶液各0.2 mL，按1.2.6.1项显色分析方法进行显色，测定并记录各对照品溶液吸光度值。以芦丁溶液的浓度（g/L）为水平坐标（x），吸光度值为垂直坐标（y），绘制对照溶液的标准曲线，考察线性关系。1.2.6.3精密度试验精密吸取1.2.6.2项下对照品溶液（1.63 g/L）0.2 mL，参考1.2.6.1项方法显色，在选定波长下，连续6次测定对照品溶液吸光度值，计算相对标准偏差（RSD）。1.2.6.4稳定性试验精密称取AG细粉0.5 g，按1.2.6.1项方法制备供试品溶液，在0、2、4、8、12、24 h显色，分别测定吸光度值，计算RSD值。1.2.6.5重复性试验精密称取同批次AG细粉6份，每份0.5 g，按1.2.6.1方法制备6份AG样品溶液，显色，测定并记录各供试品溶液吸光度值，代入线性回归方程计算AG中总黄酮含量及RSD值。1.2.6.6加样回收率试验精密称取同批次已知含量的AG细粉6份，每份0.25 g，精确加入适量体积的芦丁溶液，参考1.2.6.1项供试品溶液制备方法制备样品溶液，显色，测定并记录各溶液在选定波长下的吸光度值，代入线性回归方程计算各样品溶液中总黄酮回收率及RSD值。回收率=(加标试样测定值－试样测定值)/加标量×100%(2)1.2.6.7样品总黄酮含量精密称取20200601、20200602、20200603批次的AG细粉各0.5 g，按1.2.6.1项方法平行2份制备各批次AG供试品溶液，显色，在选定波长下测定并记录各供试品溶液吸光度值，根据线性回归方程计算每批AG样品中总黄酮含量。2结果与分析2.1薄层鉴别结果2.1.1黄芪薄层色谱鉴别（见图1）由图1可知，在与黄芪对照药材TLC相应位置上，供试品溶液TLC显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.F001图1黄芪薄层色谱鉴别注：1~3为复方黄芪饲料添加剂供试品溶液，4为黄芪对照药材溶液，5为缺黄芪阴性对照溶液。2.1.2甘草薄层色谱鉴别（见图2）由图2可知，在与甘草对照药材TLC相应位置上，供试品溶液TLC显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.F002图2甘草薄层色谱鉴别（a） 日光下检识 （b） 紫外光灯365 nm下检识注：1~3为复方黄芪饲料添加剂供试品溶液，4为甘草对照药材溶液，5为缺甘草阴性对照溶液。2.1.3白茅根的薄层色谱鉴别（见图3）由图3可知，与白茅根对照药材相应的TLC位置上，供试品溶液TLC显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.F003图3白茅根的薄层色谱鉴别（a） 日光下检识 （b） 紫外光灯365 nm下检识注：1~3为复方黄芪饲料添加剂供试品溶液，4为白茅根对照药材溶液，5为缺白茅根阴性对照溶液。2.1.4茜草的薄层色谱鉴别（见图4）由图4可知，在与茜草对照药材相应的TLC位置上，供试品溶液TLC显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.F004图4茜草的薄层色谱鉴别注：1~3为复方黄芪饲料添加剂供试品溶液，4为茜草对照药材溶液，5为缺茜草阴性对照溶液。2.2AG醇溶性浸出物测定结果（见表1）由表1可知，3个不同批次AG的浸出物测定结果相近，均值为39.86%。本研究对AG水溶性浸出物进行测定，含量接近100%，说明所含挥发性成分较少。在醇溶性浸出物含量均值的80%确定其含量限度，即AG醇溶性浸出物含量（%）不得低于31.89%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.T001表1AG醇溶性浸出物测定结果批号醇溶性浸出物水溶性浸出物浸出物含量平均值浸出物含量平均值2020060140.1939.8699.80100.292020060239.78100.542020060339.62100.52%2.3总黄酮含量测定结果2.3.1复方黄芪饲料添加剂供试品及芦丁对照品溶液的UV图谱（见图5）由图5可知，两者在335 nm处都有最大吸光度，故以335 nm为检测波长，并通过芦丁含量标示黄芪复方饲料添加剂中总黄酮含量。图5复方黄芪饲料添加剂供试品及芦丁对照品溶液的UV图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.F5a1（a）复方黄芪饲料添加剂供试品溶液UV图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.F5a2（b）芦丁对照品溶液UV图谱2.3.2芦丁对照品溶液的标准曲线（见图6）由图6可知，以芦丁溶液浓度（g/L）为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程为y=0.338 5x+0.142 6，R2=0.995 5。在0.15~2.44 g/L范围内，对照品溶液浓度与吸光度之间呈良好的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.F006图6芦丁对照品溶液的标准曲线2.3.3精密度试验结果（见表2）由表2可知，芦丁对照品溶液的吸光度RSD在1%以内（n=6），说明仪器精密度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.T002表2精密度试验结果项目123456平均值RSD/%吸光度0.7180.7180.7160.7180.7170.7150.7170.1762.3.4稳定性试验考察结果（见表3）由表3可知，AG供试品溶液在选定波长335 nm下的吸光度RSD值小于2%（n=6），表明样品溶液在24 h内稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.T003表3稳定性考察结果项目0 h2 h4 h8 h12 h24 h平均值RSD/%吸光度0.4750.4810.4820.4830.4920.4860.4831.672.3.5重复性试验考察结果（见表4）由表4可知，该AG中的总黄酮含量的RSD值在3%以内（n=6)，该方法重现性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.T004表4重复性考察结果项目样品重量/g吸光度含量/(mg/g)含量均值/(mg/g)RSD/%10.500 10.46719.16319.7332.09020.501 20.48520.18230.500 40.47919.86040.500 30.48220.04150.501 40.47019.29060.503 30.48119.8632.3.6加样回收率试验考察结果（见表5）由表5可知，AG中总黄酮回收率在95%~105%范围内，RSD值不超过3%，方法准确性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.T005表5加样回收率考察结果样品重量/mg加入量/mg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%4.944.8910.06104.70102.112.684.934.899.7398.164.924.899.82100.204.984.8910.11104.914.974.899.91101.024.994.8910.06103.682.3.7总黄酮含量测定结果（见表6）由表6可知，总黄酮含量稳定，均值为19.76 mg/g，由AG中总黄酮含量均值的80%确定其含量限度，即AG中总黄酮含量不得低于15.81 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.025.T006表6AG中的总黄酮含量（n=3）批次含量均值2020060119.7719.762020060219.902020060319.62mg/g3讨论3.1AG薄层色谱条件的优化参考2020版《中国药典》，对AG中药物进行定性鉴别[23]，进行白茅根薄层鉴别时，白茅根阴性对照溶液干扰较大。本研究参考AG提取、制备方法，对供试品、对照药材及缺白茅根的对照药材进行提取和色谱展开体系的优化。优化后的色谱体系中，AG中白茅根薄层斑点清晰，经过提取、处理后的茅根阴性对照溶液无干扰。在茜草的TLC定性鉴别中，样品溶液制备过程中，或制备得到的终溶液极易出现沉淀，可能导致薄层斑点出现清晰度不一致等情况。在紫草薄层鉴别中，未检出供试品中紫草药材的薄层斑点，可能与所含萘醌类成分的挥发性有关，尚需进一步研究。3.2AG总黄酮测定吸收波长的考察由黄酮母核结构紫外光谱特性可知[24]，色原酮结构在紫外光下呈带Ⅱ吸收峰，含氧的吡喃环2位与苯环相连在紫外光下呈现带Ⅰ吸收峰，通常情况下带Ⅰ吸收峰波长大于带Ⅱ。与典型的黄酮类化合物结构相比，异黄酮和二氢黄酮类化合物母核中的带Ⅰ结构发生改变，可使带Ⅰ吸收峰减弱或消失。AG包含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花苷等异黄酮类效用成分及甘草苷等二氢黄酮类效用成分[22]，可能使供试品显色体系中的带Ⅰ吸收峰减弱或消失。由全波长扫描图可知，AG供试品溶液及芦丁对照品溶液显色体系在335 nm附近均存在相似的强吸收峰。芦丁（黄酮）在510 nm附近也存在一个较弱的吸收峰。因此，本研究选择335 nm作为测定波长的考察结果与理论相一致。3.3AG提取方法及总黄酮含量测定本研究前期在对AG进行测定时，以50%甲醇为提取剂，通过超声提取法，考察超声时间、液料比等提取条件，结果表明，超声时间对AG总黄酮的提取率影响不大，且液料比在20 mL/g时总黄酮提取率趋于平衡[22]。因此，选择液料比20 mL/g、超声10 min作为AG的优化提取条件，此条件下测定的3批AG总黄酮含量均值为19.76 mg/g，此基础上下浮20%，制定本制剂中指标成分的含量限度，即总黄酮含量不得低于15.81 mg/g。4结论本研究建立的方法简便、可行，重现性好，灵敏度、准确性高，通过定性分析及总黄酮含量测定，能够有效对AG的质量进行控制。