细菌素是由细菌基因编码核糖体合成、细菌分泌的小分子多肽或蛋白质，是天然无毒害的抑菌物质[1-3]。研究发现，产细菌素的菌株以乳酸菌为主，粪链球菌在发酵的过程中产生L型乳酸、氨基酸、维生素、酶及细菌素等物质。本试验从内蒙古牧区多处牛、羊肠道中分离筛选出1株产细菌素的粪链球菌N9301，研究其生物学特性，为开发新型微生物饲料添加剂提供参考。1材料与方法1.1试验菌株粪链球菌N9301（Streptococcus faecium N9301）、双歧杆菌N95（Bifidobacterium N95）、沙门氏杆菌C79（Salmonella C79）、鸡白痢杆菌C20（Bacillus pullorum C20 ）、大肠埃希氏菌N82（Escherichia coli N82）、金黄色葡萄球菌N90（S. aureus N90）、蜡样芽孢杆菌N93（Bacillus cereus N93），均由内蒙古农牧业科学院兽医研究所提供。1.2培养基与试剂改良番茄汁培养基、LB培养基购自青岛海博生物；胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、α-淀粉酶购自国药集团（上海）。1.3主要仪器设备YXQ-LS-50SII立式灭菌锅购自上海博讯实业有限公司医疗器械厂；BSI-160A自动部分收集器购自上海精科实业有限公司；GJ-21冷冻高速离心机购自美国贝克曼公司；UV 2100型分光光度计购自日本岛津公司；MIR-153恒温培养箱购自日本三洋（SANYO）电机公司；SW-CJ-2FD 超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；水平电泳槽及成像系统购自美国Bio-rad公司；PHS-2F pH计购自上海仪电科学仪器股份有限公司；0.22 μm Millipre滤膜购自美国MILLIPORE公司；HD-21-88核酸蛋白质检测仪购自上海琪特分析仪器有限公司。1.4测定指标及方法1.4.1样品采集及粪链球菌N9301分离从内蒙古牧区采集健康牛、羊肠道内含物样本30份。从肠道内含物中取1 g样本，使用无菌生理盐水进行梯度稀释，选取10-1、10-2、10-3三个梯度各0.1 mL分别涂布于改良番茄汁固体培养基上，37 ℃倒置培养24 h。挑取培养基上不同形态的菌落进行划线纯培养。在培养基上挑取灰白色、表面光滑、边缘整齐的单一菌落于改良番茄汁液体培养基中培养24 h。对菌落有氧、无氧进行培养以及进行一系列生理生化试验分析。指标参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》及《伯杰氏细菌鉴定手册》[4]操作。1.4.2试验菌抑菌活性以肠道致病菌和肠道常见的正常菌为指示菌株，以筛选出的粪链球菌N9301为指示菌，根据琼脂扩散试验法[5-7]，测定试验菌种与其他肠道正常菌及与致病菌间的生长拮抗关系。使用粪链球菌N9301发酵液培养24 h，测定指示菌的体外抑菌效果。1.4.3pH值对粪链球菌N9301生长的影响粪链球菌N9301菌株以1%接种量接种于pH值3~10的100 mL液体改良番茄汁培养基中。37 ℃静止培养12 h，采用平板菌落计数法[8]测定细菌数量。1.4.4试验菌种的发酵试验粪链球菌N9301菌种种子液以1%的接种量转接于250 mL液体改良番茄汁培养基中，37 ℃厌氧发酵24 h，间隔2 h取样，测定OD600 nm吸光度和pH值，4 ℃、3 000 r/min离心30 min取上清，以肠道致病性大肠杆菌N82为指示菌测定抑菌圈。培养至最佳发酵时间，离心，取上清液，中和pH值至5.0，测定抑菌圈直径(mm)。使用pH值5.0乳酸作为对照。1.4.5细菌素的纯化采用Bradford检测法[9]对粪链球菌N9301发酵上清过滤液进行蛋白质含量的测定。使用（20%、40%、50%、60%、70%、80%）饱和度的硫酸铵溶液对过滤的上清液透析，确定最佳硫酸铵饱和度。测定上清液和沉淀物水溶液的抑菌活性，指示菌为肠道致病性大肠杆菌N82。测定最佳硫酸铵饱和度下盐析的沉淀物水溶液进行蛋白质含量。透析得到细菌素粗提液，转入1.0 kDa透析袋4 ℃去离子水透析，进一步层析纯化。采用Sephadex G-100葡萄糖凝胶柱（1.5 cm×80 cm）层析。使用pH值6.0 50 mmol/L的磷酸钠缓冲液以流速为1.0 mL/min洗脱。检测每管收集液抑菌活性，测定OD600 nm值最高的收集液（管）蛋白质含量。将Marker和凝胶柱过滤峰值液依次加入上样孔中进行SDS-PAGE凝胶电泳。1.4.6细菌素粗提液的理化性质检测将粪链球菌N9301的发酵上清液分别在不同温度（37、60、80、100 ℃）水浴处理30 min，121 ℃高压蒸汽处理15 min；不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和13.0）处理2 h，调回pH值7.0；不同酶（蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、α-淀粉酶）37 ℃，pH值7处理6 h，100 ℃灭活10 min，最终酶浓度为l g/L。以未处理的细菌素粗提液作为对照。以肠道致病性大肠杆菌N82为指示菌检测抑菌活性，探索不同处理条件对粪链球菌N9301细菌素粗提液抑菌活性的影响。2结果与分析2.1粪链球菌N9301的部分生物学特性2.1.1试验菌株培养及生化特性（见表1）由表1可知，参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》及《伯杰氏细菌鉴定手册》初步判断菌株N9301为粪链球菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.017.T001表1试验菌株培养及生化特性项目结果革兰氏染色阳性球菌、单个或成对菌落特征灰白色、表面光滑、边缘整齐厌氧性兼性厌氧15~45 ℃培养条件下含4 %胆汁的培养基+15~45 ℃培养条件下含6.5 %氯化钠的培养基+15~45 ℃培养条件下含0.1 %醋酸铊的培养基+葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、密二糖+果糖、纤维二糖、乳糖、蔗糖、海藻糖+松三糖、山梨醇、菊糖、木糖-还原四唑氮为淡红色和黄色+注：“+”为阳性；“-”为阴性。2.1.2菌株N9301抑菌试验结果（见表2）由表2可知，几种常见消化道致病菌抑菌直径为5~29 mm，对消化道其他正常微生物抑制无明显作用。饲料添加剂特别是生物发酵饲料与肠道正常菌和致病菌的关系决定饲料添加剂的应用效果。粪链球菌N9301对正常肠道菌无任何的抑制作用，对肠道致病菌有明显的抑制作用。因此，粪链球菌N9301在饲料添加剂中可以很好地预防畜禽的消化道疾病，从而减少饲料中抗生素的添加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.017.T002表2菌株N9301抑菌试验结果指示菌类别抑菌直径/mm双歧杆菌N950.00大肠埃希氏菌N8212.84沙门氏杆菌C7919.17鸡白痢杆菌C2029.03金黄色葡萄球菌N905.63蜡样芽孢杆菌N9318.012.1.3试验菌株在不同酸碱环境下的生长情况粪链球菌N9301有较强的耐酸碱能力，在pH值4.0以下无法生长，pH值4.2以上开始生长，pH值大于10.0无法生长。较强的耐酸、碱能力使粪链球菌N9301在畜禽胃肠道中也具有较强的活性，在发酵饲料中可以使粪链球菌N9301具有微生态制剂的作用。2.2粪链球菌N9301发酵特性的初步研究2.2.1试验菌株N9301的抑菌活性（见图1）由图1可知，试验菌株随着发酵时间的增加pH值逐渐降低、OD600 nm值逐渐增高。0~8 h时活菌总数指数式的增长，8 h后增长逐渐放缓。N9301试验菌株的发酵液抑菌活性的变化与OD600 nm值变化趋势相同，随发酵的时间的增长而增大，在发酵时间16 h达到最大值。图1试验菌株N9301的抑菌活性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.017.F1a1（a）pH值与抑菌直径的变化曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.017.F1a2（b）OD600 nm与抑菌直径的变化曲线2.2.2试验菌株发酵上清液的抑菌活性（见图2）由图2可知，菌株N9301发酵上清液对肠道致病性大肠杆菌N82具有明显抑菌作用，对照组乳酸几乎无抑菌作用。试验表明菌株发酵产生的有机酸无抑菌效果，菌株N9301发酵上清液的抑菌作用主要是在发酵过程中产生的物质而不是有机酸。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.017.F002图2试验菌株发酵上清液的抑菌活性注：1为乳酸，2为菌株N9301。2.3试验菌株细菌素的纯化2.3.1试验菌株增殖及离心去菌上清液的蛋白含量粪链球菌N9301增殖及离心去菌上清液的蛋白含量为389.3 μg/g。2.3.2硫酸铵盐析初步分离粪链球菌N9301的细菌素硫酸铵饱和度为小于40%时，沉淀较少并无抑菌活性，随硫酸铵饱和度的上升，粪链球菌N9301发酵上清液沉淀物的抑菌活性先上升后下降。硫酸铵饱和度为70%时，抑菌活性达到最大。以70%硫酸铵进行盐析，沉淀物水溶液的蛋白含量为170.068 μg/g。2.3.3试验菌株硫酸铵盐析沉淀物的透析结果70% (NH4)2SO4盐析沉淀物的水溶液透析后，袋内抑菌活性无减少，袋外没有检测出抑菌活性，透析袋内溶液蛋白含量为85.9 μg/g。2.3.4试验菌株细菌素浓缩液的凝胶柱过滤结果粪链球菌N9301细菌素浓缩液在凝胶柱过滤洗脱86~92 min出现1个峰值，在此峰值处的共6管收集液抑菌活性处于峰值。位于峰值处中央的第89管收集液的蛋白含量为6.546 μg/g。2.3.5试验菌株SDS-PAGE分析粪链球菌N9301在15%的分离胶的电泳条件下无蛋白条带，可能是N9301细菌素分子量小于10 kDa，需进一步进行Tricine-SDS-PAGE检测。2.4粪链球菌N9301细菌素粗提液抑菌物质2.4.1温度对粪链球菌N9301细菌素粗提液的影响（见图3）由图3可知，粪链球菌N9301的细菌素粗提液具有良好的热稳定性，37、60、80、100 ℃水浴中处理30 min仍具有抑菌活性，121 ℃高压灭菌锅处理15 min失去抑菌活性。图3温度对粪链球菌N9301细菌素粗提液的影响注：b中1为37 ℃，2为60 ℃，3为80 ℃，4为100 ℃，5为121 ℃，中间孔为对照（30℃）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.017.F3a1（a）不同温度处理粪链球菌N9301细菌素粗提液的稳定性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.017.F3a2（b）粪链球菌N9301细菌素粗提液不同温度下抑菌作用2.4.2pH值对粪链球菌N9301细菌素粗提液的影响（见图4）由图4可知，试验菌株在饲料的发酵过程中或是直接添加过程中会大量繁殖增殖，可以随着发酵饲料进入动物肠道，需要试验菌株耐受动物胃肠道中的酸碱环境，特别是胃酸的考验。粪链球菌N9301细菌素粗提液在pH值2~13时均对大肠杆菌具有很强的抑菌活性，特别是在低酸的环境中活性比较强。表明粪链球菌N9301细菌素粗提液完全可以适应动物胃肠道中的低酸环境而发挥抑菌性能。细菌素可以随着饲料进入畜禽的肠道，不被肠道的胃液所消耗，从而发挥益生的功能。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.017.F004图4pH值对粪链球菌N9301细菌素粗提液的影响2.4.3酶处理对粪链球菌N9301细菌素粗提液的影响（见图5）由图5可知，1 g/L的α-淀粉酶处理，粪链球菌N9301具有一定的抑菌活性，证明碳水化合物部分没有起抑菌作用，胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后抑菌活性部分失活，证明N9301产生的细菌素粗提液是蛋白类物质。图5酶处理对粪链球菌N9301细菌素粗提液的影响注：b中1为蛋白酶K，2为α-淀粉酶，3为胃蛋白酶，4为胰蛋白酶，中间孔为对照为粗提液。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.017.F5a1（a）不同酶处理粪链球菌N9301细菌素粗提液的稳定性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.017.F5a2（b）粪链球菌N9301细菌素粗提液不同酶处理下抑菌作用3讨论常用发酵饲料添加剂有：酸化剂、益生菌、酶制剂等。微生物产细菌素是蛋白类物质，具有耐酸碱、耐高温等特性。目前，多数报道集中在乳酸菌产细菌素，关于粪链球菌的研究相对较少，粪链球菌是动物肠道内普遍存在的菌种之一，是动物微生态的优势菌之一，具有种类多、发布广泛、易培养、加工损失率低等特点。粪链球菌可以在肠道内顺利存活，保证在肠道内发挥作用[10]，可以在极端低温条件下生长[11]，组成的微生物菌群不仅有良好的生物学特性，而且可以改善机体营养物质的消化吸收，提高动物体免疫能力[12]，拥有丰富的细菌素资源。动物胃肠道内pH值变化大，易引起胃肠道内细菌生长变化，影响有益菌的生长繁殖[5]。禽类的胃内pH值为2.5~5.1[13]，反刍动物瘤胃pH值维持在5.5~7.0之间。乳酸链球菌素在酸性环境下有很强的活性，在中性、碱性环境时，活性丧失[14]。Minnaard等[15]从蜡样芽孢杆菌分离到的BLIS m6c和BLISm 387，在pH值3.0~7.0范围内活性稳定。粪链球菌N9301细菌素粗提液在pH值2~8时，均显示很强的抑菌活性。饲料添加剂的热加工处理方式是细菌素常用的一类应用方法，需要考虑细菌素的热稳定性。据报道，解淀粉芽孢杆菌RX7所产细菌素100 ℃处理30 min，活性保留80%，具有良好的热稳定性[16]。N9301的细菌素粗提液在100 ℃处理30 min，细菌素粗提液仍具有一定的抑菌活性。不同菌种所产细菌素对蛋白酶的敏感性会有很大差异。地衣素50.2可被链霉蛋白酶E和蛋白酶K完全失活，可被胰蛋白酶部分失活[17]。本试验中，粪链球菌N9301细菌素粗提液在胃蛋白酶和胰蛋白酶处理下抑菌活性部分失活。进行SDS-PAGE分析中N9301在15%的分离胶的电泳条件下也无跑出蛋白条带，可能是N9301细菌素分子量小于10 kDa，产细菌素可能属于小分子的热稳定肽（SHSP）。本试验采用较为常用的蛋白质纯化方法：盐析、透析和凝胶色谱。纯化结果较差，细菌素的回收率为1.68%，回收率较低，但改纯化方法比较容易操作、试验要求与费用偏低，有利于后续的中试试验。4结论试验从健康动物肠道中分离得到产细菌素的粪链球菌N9301，菌株特性优良。粪链球菌N9301本身具有良好的抑菌效果。粪链球菌N9301产生的细菌素粗体液具有较强的酸碱稳定性、热稳定性，是一种类蛋白质物质，具有成为饲料添加剂开发的备选菌株潜力。