噬菌体是侵染细菌和放线菌的病毒,具有超显微、无细胞结构、专性活细胞寄生等特征[1]。噬菌体污染现象普遍在氨基酸发酵工业存在[2],会造成发酵周期延长、发酵产量降低、倒罐、经济损失、浪费时间等问题[3]。为防止噬菌体的污染,通常采取“预防为主,防重于治”的措施,如保持生产现场环境清洁、培养基及发酵管道灭菌彻底、不留死角、定期更换生产菌等。大肠杆菌YPT在发酵生产苏氨酸过程中,有时会感染噬菌体,导致苏氨酸产酸指标严重降低,增加苏氨酸生产成本。因此,以YPT为出发菌,拟采用诱变筛选到1株抗噬菌体的突变株。常压室温等离子体(ARTP)是一种能够在大气压下产生温度在25~40 ℃、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体流。ARTP富含的活性能量粒子对细菌的遗传物质造成损伤,诱发生物细胞启动SOS修复机制。SOS修复是一种高容错率修复过程,修复过程中会产生种类丰富的错配位点,最终稳定遗传进而形成突变株。本研究通过ARTP诱变苏氨酸生产菌YPT,以从苏氨酸发酵染噬菌体的发酵液中分离得到的混合噬菌体P-1为筛选因子,筛选得到1株抗多种噬菌体的产苏氨酸的突变株YPT-1,进一步考察该突变株在3 L发酵罐中的发酵产酸性能,在分子水平上探讨该突变株对噬菌体P-1的抗性机制,为L-苏氨酸的工业化发酵以及其他菌种的防治噬菌体侵染改造提供参考。1材料与方法1.1菌株和噬菌体苏氨酸生产菌大肠杆菌YPT由宁夏伊品生物科技有限公司菌种室保藏。E. coli DH5α购自大连宝生物工程有限公司;质粒pMD19-T vector购自大连宝生物工程有限公司;pGRB、pRED-Cas9质粒均购自Addgene;噬菌体P-1分离购自宁夏伊品生物科技有限公司苏氨酸发酵车间染噬菌体批次[4]。1.2引物序列PCR扩增体系:10×Ex Taq Buffer 5 μL、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4 μL、Mg2+(25 mmol/L)4 μL、引物(10 pmol/L)各2 μL、ExTaq(5 U/μL)0.25 μL,总体积50 μL。PCR扩增反应程序为:94 ℃预变性5 min,(94 ℃变性30 s;52 ℃退火30 s;72 ℃延伸40 s;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。引物序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.T001表1引物序列引物序列(5'→3')gRNA-fhuA-SAGTCCTAGGTATAATACTAGTCGCAGTTGTAGTAGCCACAGGTTTTAGAGCTAGAAgRNA-fhuA-ATTCTAGCTCTAAAACCTGTGGCTACTACAACTGCGACTAG ATTATACCT AGGACTUP-fhuA-SGTCAGCTTGGGGCGAAATACUP-fhuA-AGTGTGGTCGATATCGCCAGTGGTGGTATATCTCTGATGTAAAGTGDN-fhuA-SCACTTTACATCAGAGATATACCACCACTGGCGATATCGACCACACDN-fhuA-AGGATCTCGCCACCTTCAAC△fhuA-SCTTCAGGAACGCTCAGATTG△fhuA-AATAACGACC CCTAGGGTGACC1.3培养基蛋白胨水[5]:蛋白胨10 g/L。2×YT培养基:胰蛋白酶16 g/L、酵母抽提物10 g/L、氯化钠5 g/L。种子培养基:多聚蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO4 0.4 g/L、KH2PO4 2 g/L。固体培养基:种子培养基+1.5%琼脂。发酵培养基:葡萄糖22.2 g/L、(NH4)2SO4 2.8 g/L、糖蜜17 g/L、KCl 0.89 g/L、FeSO4 0.016 g/L、MnSO4 0.016 g/L、甜菜碱0.5 g/L、MgSO4 0.89 g/L、玉米浆25 g/L、H3PO4 1.1 g/L、pH值6.8~7.0。流加培养基:葡萄糖600 g/L。双层LB培养基:蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 5 g/L、pH值7.0~7.2,底层培养基琼脂浓度1.5%,上层培养基琼脂浓度0.7%。肉汤培养基:牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L;加倍肉汤培养基:成分与肉汤培养基相同,浓度加倍。加镁磷酸盐缓冲液:KH2PO4 2 g/L、K2HPO4 7 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L。1.4测定指标及方法1.4.1噬菌体的分离1.4.1.1噬菌体富集液的制备取5 mL L-苏氨酸发酵中染噬菌体的发酵液,12 000 r/min离心5 min,取1 mL上清液转接于50 mL三角瓶中(装有处于对数期的L-苏氨酸生产菌培养液8 mL),37 ℃、180 r/min培养1 h,培养液由浑浊变澄清。将上述培养液加入EP管,12 000 r/min离心5 min,过0.22 μm双层微孔滤膜除菌,既得富集好的噬菌体裂解液,4 ℃保存。1.4.1.2噬菌体效价采用双层平板法[6]进行噬菌体效价测定。将稀释到适当梯度的噬菌体裂解液100 μL与900 μL过夜培养的苏氨酸生产菌YPT混匀,加入5 mL半固体LB培养基(琼脂含量0.7%、50 ℃水浴保温),混匀,倒入加有底层培养基的平板中(15 mL琼脂含量1.5% LB固体培养基),即双层平板。37 ℃静置培养3~4 h,观察噬菌斑形成情况并计数。每个稀释梯度做2个平行。1.4.2ARTP诱变苏氨酸生产菌YPT1.4.2.1ARTP诱变YPT致死率曲线ARTP对苏氨酸生产菌YPT进行诱变。ARTP额定功率为150 w,利用99.99%氦气为载气,流量8 L/min,等离子体发射源与裁片距离选择2 mm,YPT培养至对数期OD600 nm吸光度0.4~0.6,培养4 h,点样10 μL,分别选择20、25、30、35、40、45、50、55 s处理时间。将处理过的样品稀释到适当梯度,取100 μL涂板,每个稀释度做3个平行。以未做处理的YPT培养液作为对照,计算致死率。致死率=(对照每毫升菌液菌落数-诱变后每毫升菌液菌落数)/对照每毫升菌液菌落数×100%(1)1.4.2.2ARTP诱变苏氨酸生产菌采用接种环挑一环苏氨酸生产菌YPT加入含有8 mL种子培养基的50 mL三角瓶,37 ℃、180 r/min培养4 h至OD600 nm吸光度达到0.4~0.6。取10 μL培养液进行ARTP诱变,诱变时间选择致死率达到99%的处理时间。诱变后,将载片放入含1 mL种子培养基的EP管中,漩涡振荡30 s,12 000 r/min离心5 min,除去上层900 μL培养基,加入100 μL P-1裂解液,将诱变菌与噬菌体裂解液混匀,倒双层平板。37 ℃静置培养过夜,观察平板上是否长出单菌落。若有单菌落长出,挑取该单菌落于另一平板活化,做进一步的苏氨酸产酸及噬菌体抗性验证。1.4.3噬菌体抗性突变株溶原性验证为确保本试验筛到的突变株的安全性,需要检测突变株是否为溶原性细菌。因此,选用紫外线结合丝裂霉素C的双重诱导法进行验证。1.4.3.1紫外诱导法检测噬菌体抗性突变株挑取一环噬菌体抗性突变株接入盛8 mL种子培养基的50 mL三角瓶,37 ℃、180 r/min培养4 h至对数期(OD600 nm 0.4~0.6)。取2 mL培养液于EP管,12 000 r/min离心3 min,移去上清液,加入2 mL加镁磷酸盐缓冲液洗涤2次,加1 mL加镁磷酸缓冲液将菌体溶解。按步骤(1)收集4 mL含镁离子磷酸盐缓冲液制成的细胞悬浮液加入直径7.5 cm的培养皿,在距20 w紫外灯20 cm处分别照射10、15 s,加入加倍肉汤4 mL,37 ℃、180 r/min下避光培养2 h。取出培养结束的4 mL菌液,加入0.5 mL氯仿,漩涡振荡45 s,12 000 r/min离心3 min,收集上清液。将以上步骤得到的上清液100 μL与培养至对数期的YPT培养液(OD600 nm 0.4~0.6)100 μL混匀,涂平板,37 ℃静置培养过夜,观察有无噬菌斑出现。1.4.3.2丝裂霉素C诱导抗噬菌体突变株[7]从平板上挑取对混合噬菌体P-1有抗性的突变株一接种环,转接于50 mL三角瓶(装有8 mL一级种子培养基),37 ℃、180 r/min培养3~4 h(OD600 nm 0.4~0.6)。取培养液200 μL转接于8 mL新鲜一级种子培养基,加入丝裂霉素C(已过双层0.22 μm细菌滤膜除菌)至终浓度0.5 mg/L;37℃、180 r/min诱导培养16 h。取诱导3 mL加入0.4 mL氯仿,漩涡振荡1 min,12 000 r/min离心5 min,取上清液120 μL与80 μL对数期YPT培养液混匀,涂布平板,37 ℃培养过夜,观察有无噬菌斑形成。1.4.4噬菌体抗性突变株小试发酵产苏氨酸采用3 L和50 L发酵罐对筛到的抗混合噬菌体P-1的突变株进行小试发酵产苏酸验证。从平板上用接种环挑取抗混合噬菌体P-1的突变株,转接于500 mL挡板三角瓶,37℃、180 r/min培养7~8 h至OD600 nm达到1.56~1.95。按接种量12.6%将种子培养液接入3 L和50 L发酵罐进行发酵产酸,采用分批补料发酵,发酵周期为30 h和36 h。发酵过程中通过补加氨水,将pH值控制在6.8~7.0;发酵温度37 ℃;通过流加60%葡萄糖,将残糖控制在0.3~0.4。发酵前8 h,发酵液溶解氧控制在40%左右;发酵中、后期,通过增加发酵罐转速、通风量控制溶解氧不低于30%。1.4.5抗噬菌体突变株遗传稳定性验证将抗混合噬菌体P-1的突变株在平板上连续传代培养至第十代,挑一接种环于一级种子培养基(50 mL三角瓶,装液量8 mL),37 ℃、180 r/min培养约4 h,取100 μL涂平板,滴加数滴P-1噬菌体液。37 ℃静置培养过夜,观察有无噬菌斑出现。1.4.6铁铬外膜转运蛋白fhuA基因的敲除[8-10]通过NEBuilder高保真DNA组装克隆试剂盒(NEB)将含有gRNA的双链片段连接到pGRB质粒中获得gRNA表达质粒,采用overlaping PCR获得敲除基因的同源臂片段,通过电转法将pREDCas9质粒转入到苏氨酸生产菌YPT,将单个菌落于LB培养基中32 ℃过夜培养,采用10%接种液将培养物转移到2×YT培养基。细胞在32 ℃、OD600 nm为0.1~0.2时,加入0.1 mmol/L IPTG诱导重组酶的表达,继续培养细胞,收集细菌并制备称电转感受态细胞,将200 ng的同源臂片段及100 ng gRNA质粒加入到感受态细胞中并用电转仪进行电转(0.1 cm、1.8 kV)。电穿孔后的细胞立即加入1 mL LB,32 ℃下恢复2 h,涂布于含有氨苄霉素和大观霉素的LB平板。32 ℃过夜培养,以菌落PCR验证单个菌落。随机选择的阳性转化子通过DNA测序进行确认。将正确的菌落接种于含有0.2% L-阿拉伯糖的LB,培养过夜可消除质粒pGRB,质粒pRED-Cas9可在42 ℃下培养6~8 h消除。2结果与分析2.1混合噬菌体P-1效价的测定噬菌斑(见表2)在YPT工业化发酵生产L-苏氨酸染噬菌体的发酵液中富集、分离得到噬菌体P-1。将YPT富集液按10倍梯度稀释法,直至稀释至10-21,按照1.4.1.2方法测定P-1的噬菌体效价。不同稀释度噬菌斑计数见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.T002表2不同稀释度噬菌斑计数稀释度10-1910-2010-211#2#平均1#2#平均1#2#平均噬菌斑数124126125322629655.5由表2可知,10-19稀释度噬菌斑数在30~300之间,且两平行样计数结果接近。因此,选10-19稀释度的平均噬菌斑数计算P-1的效价。经计算,P-1的效价为1.245×1022 PFU/mL。2.2ARTP诱变菌株YPT致死率曲线(见图1)物理诱变过程中当目标菌的致死率达到90%以上时,突变率会急剧上升。因此,在ARTP诱变、紫外线诱变等物理诱变过程中,需要测定目标菌的致死率,以便选择合适的诱变处理时间。按照1.4.1.1方法测定YPT的ARTP诱变致死率曲线。由图1可知,当ARTP处理时间为20 s时,YPT就开始大量死亡,致死率为67.86%;当处理时间为40 s时,致死率达到90.00%;当处理时间为55 s的时候致死率已接近100.00%,达到99.10%。考虑处理时间过长可能会导致已发生突变的菌被杀死。因此,选择处理时间为40 s为最终的ARTP诱变处理时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.F001图1ARTP诱变菌株YPT致死率曲线2.3ARTP诱变YPT筛选抗噬菌体突变株2.3.1ARTP诱变YPT抗性平板初筛(见图2)利用ARTP诱变苏氨酸生产菌YPT,处理40 s。在固体平板上长出一个单菌落,经过固体平板噬菌体抗性复筛、液体培养侵染试验及小试发酵产酸验证,确定该单菌落为对噬菌体P-1具有抗性且产苏氨酸的突变株,命名为YPT-1。“×”为滴加P-1的位置,涂有YPT-1的平板无噬菌斑,涂有YPT的平板有噬菌斑,说明YPT-1对P-1有抗性,但YPT对P-1无抗性。由图2可知,YPT-1仍具有完整细胞,YPT已无完整细胞。图2ARTP诱变后菌株YPT-1和YPT对噬菌体P-1抗性检测10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.F2a1(a)YPT-1和YPT对噬菌体P-1敏感性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.F2a2(b)YPT-1与YPT培养液光学显微镜结果2.3.2YPT-1溶原性验证(见图3)为检测YPT-1对P-1抗性的有效性,采用整合噬菌体P-1基因方法构建溶原性细菌,使用紫外诱变诱导和丝裂霉素C诱导两种方法进行检测。由图3可知,检测平板上无噬菌斑形成。通过丝裂霉素C诱导法检测发现,经丝裂霉素C(终浓度0.5 mg/L)诱导16 h后,YPT-1培养液依然浑浊,未变澄清(图片未显示);检测平板上无噬菌斑形成。因此,说明YPT-1非溶原性细菌,即P-1为烈性噬菌体混合体。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.F003图3溶原菌的紫外诱导法检测结果2.3.3YPT-1发酵产苏氨酸(3 L发酵罐)为考察抗噬菌体突变株YPT-1产苏氨酸能力与诱变出发菌YPT相比是否有变化,以3 L发酵罐对YPT-1进行3批次的小试产酸验证,采用分批补料发酵方式。诱变前后菌株3 L发酵罐苏氨酸产量及转化率见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.F004图4诱变前后菌株3 L发酵罐苏氨酸产量及转化率由图4可知,抗噬菌体突变株YPT-1与诱变出发菌YPT相比,主要产酸指标相差不大,苏氨酸产量均约为109 g/L,糖酸转化率均在51%左右,表明YPT-1在具有多种噬菌体抗性的同时,产酸指标比较稳定且未下降。因此,认为YPT-1是一株产酸稳定性更好且抗噬菌体的优良苏氨酸生产菌株。2.3.4YPT-1对噬菌体P-1抗性遗传稳定性检测结果(见图5)由图5可知,经ARTP诱变选育的突变株在传代过程中可能存在表型延迟、回复突变及自然分化的现象,不稳定因素的存在会导致突变株在传代过程中,对混合P-1的抗性减弱或消失。因此,需要对YPT-1进行噬菌体抗性遗传稳定性验证。结果显示,YPT-1经过连续传代至第10代,仍然对P-1具有抗性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.F005图5YPT-1对噬菌体P-1抗性遗传稳定性检测结果注:“×”为噬菌体P-1滴加位置。2.3.5YPT-1发酵产苏氨酸(50 L发酵罐)采用上述传代良好的抗噬菌体菌株YPT-1进行50 L发酵罐生产苏氨酸,进行3个批次的发酵,不同时刻苏氨酸浓度及细胞密度。50 L发酵罐生产苏氨酸和细胞密度情况见图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.F006图650 L发酵罐生产苏氨酸和细胞密度情况由图6可知,接种后12 h时,苏氨酸含量为27.7 g/L,之后呈快速增长;36 h放罐时,苏氨酸含量达117.1 g/L。菌株细胞密度在12 h时达到46.3 g/L,之后上升至51.0~52.0 g/L,放罐时下降至47.1 g/L。50 L发酵罐发酵结束后发酵液中的16种氨基酸含量见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.T003表350 L发酵罐发酵结束后发酵液中的16种氨基酸含量项目发酵批次1发酵批次2发酵批次3天门冬氨酸/(g/L)——0.09谷氨酸/(g/L)4.19—0.26丝氨酸/(g/L)———精氨酸/(g/L)———甘氨酸/(g/L)0.44—0.39酪氨酸/(g/L)——0.29脯氨酸/(g/L)———丙氨酸/(g/L)0.52—0.12缬氨酸/(g/L)0.560.140.22蛋氨酸/(g/L)—0.27—半胱氨酸/(g/L)———异亮氨酸/(g/L)0.630.710.95亮氨酸/(g/L)0.26——苯丙氨酸/(g/L)———赖氨酸/(g/L)0.99—0.08苏氨酸/(g/L)111.29123.31116.70总氨基酸/(g/L)118.88124.43119.09其余氨基酸/(g/L)7.591.122.39苏氨酸占总氨基酸比/%93.6099.1098.00注:“—”为未检出。由表3可知,其他主要氨基酸均较少,苏氨酸占总氨基酸比达到98%以上,仅批次1中发现谷氨酸含量达到4 g/L左右,苏氨酸占总氨基酸比下降至93.6%。三批发酵数据显示,经诱变后具有十分稳定的抗噬菌体侵扰性能,且杂氨基酸含量极低。经紫外诱变筛选得到的菌株获得稳定的噬菌体抗性,且代谢途径未受到干扰。2.4YPT-1噬菌体抗性机制的初步研究一般认为细菌的噬菌体感染抗性机制有4种[11-12]。吸附抑制是指细菌可通过改变自身细胞膜上受体的结构或构象,使噬菌体无法与之吸附,进而达到抗噬菌体的目的。吸附抑制机制的研究中涉及5个编码膜蛋白的基因:lit[13]、ompA[14]、ompC[15]、fhuA[16-18]及tolC[19-22]。为深入探索YPT-1抗噬菌体感染的机制,分别将YPT-1和YPT的lit、ompA、ompC、fhuA、tolC基因进行测序,发现fhuA基因的编码区发生变化,即在YPT-1 fhuA基因转录起始位点ATG下游107 bp处插入1 340 bp的insCD序列。初步推断由于编码铁转运蛋白的fhuA基因发生转座重组,导致该蛋白结构发生改变,使YPT-1具备噬菌体抗性。为进一步验证是否由fhuA基因的变化导致菌株具有噬菌体抗性,采用crispr技术对fhuA基因的部分编码区进行敲除。PCR验证fhuA基因敲除结果见图7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.F007图7PCR验证fhuA基因敲除结果注:M为Marker DL 2 000;1为生产菌YPT;2为敲除菌YPT-△fhuA。由图7可知,试验得到敲除fhuA基因的突变株YPT-△fhuA。考察YPT-△fhuA对噬菌体P-1的抗性,噬菌体P-1侵染苏氨酸生产菌YPT与fhuA基因敲除菌YPT-△fhuA结果见图8。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.022.F008图8噬菌体P-1侵染苏氨酸生产菌YPT与fhuA基因敲除菌YPT-△fhuA结果注:“×”为噬菌体滴加位置。由图8可知,YPT-△fhuA对P-1具有抗性,出发菌YPT无抗性。由此表明,fhuA基因在YPT-1抵抗噬菌体P-1过程中具有决定性的作用。3讨论本研究以分离的噬菌体P-1为筛选因子,利用ARTP诱变苏氨酸生产菌YPT,得到一株抗噬菌体P-1且产苏氨酸的突变株,名为YPT-1。经溶原性检测发现,YPT-1为非溶原性细菌。对YPT-1进行产苏酸验证发现(3 L发酵罐),产酸指标与出发菌YPT相比未下降。YPT-1连续传代10代,仍然对混合噬菌体P-1具有很强的抗性。因此,YPT-1是一株对噬菌体P-1有稳定抗性的产苏氨酸突变株。对YPT-1抗噬菌体P-1的分子学机制进行初步研究。结果发现,与诱变出发菌YPT相比,在YPT-1编码铁转运蛋白的基因fhuA转录起始位置ATG下游107 bp处插入1 340 bp的insCD序列。初步推断YPT-1菌株对噬菌体的抗性机制可能与铁转运蛋白fhuA的失活有关[21],即fhuA的失活阻止噬菌体对噬菌体的吸附。在分子水平上开展对突变株YPT-1的噬菌体感染抗性机制的研究,为今后其他菌种的防治噬菌体侵染改造提供实际参考。4结论本研究通过诱变筛选获得一株产酸指标不低于出发菌株的具有噬菌体抗性的产苏氨酸的工程菌株,并通过crispr技术对fhuA基因敲除初步验证该抗性的获得与fhuA基因的缺失有直接的关系,具体的机理分析还有待进一步的研究。
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