小麦年产量巨大，小麦秸秆数量也很多。小麦秸秆的适口性较差、碳水化合物含量低[1]、营养水平较差，单独饲喂不足以满足动物所需营养水平要求，常被丢弃或焚烧，造成资源浪费。但小麦秸秆与其他优质饲料混合饲喂可产生正饲料组合效应，提高利用率[2]。苜蓿具有营养价值高、产量较高、适口性好、动物易消化的优点[3-5]。研究表明，低质饲料中添加一定量的苜蓿可在一定程度上提高低质饲料的利用率[6-7]。实际生产中，为达到所需的生产要求，需要在日粮基础上添加一定量的精料，具体添加量由基础饲料与饲养动物的生产特性决定[8]。试验旨在研究精粗比为40∶60、30∶70时，不同比例的精料、小麦秸秆、苜蓿对瘤胃体外发酵参数的影响，筛选相对最佳的比例组合。1材料与方法1.1试验材料试验所用的精料（C）、小麦秸秆（WS）、苜蓿（A）以及预混料均由沧州中特牧业提供。试验前将原料放入65 ℃烘箱烘48 h至恒重，粉碎，过20目筛，干燥密封保存。试验原料营养成分见表1。精料组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.002.T001表1试验原料的营养成分（干物质基础）项目CWSA干物质93.3191.0093.65粗蛋白质19.202.9018.65粗脂肪4.311.882.38粗灰分3.2210.4416.51中性洗涤纤维10.9572.9443.78酸性洗涤纤维8.4445.1833.74%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.002.T002表2精料组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米69.80综合净能/(MJ/kg)8.18豆粕6.40粗蛋白/%16.24棉籽粕6.00中性洗涤纤维/%15.97干酒糟及其可溶物14.70酸性洗涤纤维/%6.09石粉0.70钙/%0.56预混料0.60磷/%0.46小苏打1.20食盐0.60注：营养水平均为实测值。1.2试验设计试验采用单因子重复设计，精粗比分别是40∶60、30∶70，具体为C∶WS为40∶60（A组）、30∶70（F组），C∶A为40∶60（E组）、30∶70（K组），C∶WS∶A分别为40∶45∶15（B组）、40∶30∶30（C组）、40∶15∶45（D组）和30∶55∶15（G组）、30∶40∶30（H组）、30∶25∶45（I组）、30∶10∶60（J组），共11个组合，1个组合设3个重复，3个空白组校正。1.3体外发酵试验按照试验设计的比例配制0.5 g发酵底物，将发酵底物装入洁净干燥的纤维袋中，编号，密封，置于干燥环境。将100 mL发酵瓶编号，纤维袋放入对应发酵瓶。参照Menke等[9]方法配制人工缓冲瘤胃液，39 ℃通入CO2，直至人工缓冲瘤胃液无色。瘤胃液取自3头体况年龄相近并装有瘤胃瘘管的荷斯坦阉牛。将人工瘤胃缓冲液和荷斯坦阉牛的瘤胃液以3︰1比例混匀，每个发酵瓶装入60 mL混合瘤胃液，密封，发酵瓶置于39 ℃的恒温气浴摇床，分别在发酵开始后的第2、4、8、12、24、36、48 h测产气量，采用空白组进行对照校正。1.4测定指标及方法1.4.1产气量以及产气参数根据Mauricio等[10]方法测定产气量（GP）。将各组在2、4、6、8、10、12、24、36和48 h时产气量代入产气量模型计算产气参数。GP=a+b(1-e-ct)(1)式中：t为发酵时间（h）；GP为t时刻的产气量（mL）；a为快速降解部分产气量（mL）；b为慢速降解部分产气量（mL）；c为产气速率常数（%/h）；（a+b）为潜在产气量（mL）[11]。1.4.2干物质消化率（DMD）体外发酵48 h，采用冰水覆盖发酵瓶终止发酵，取出纤维袋以流动的蒸馏水冲洗干净，105 ℃烘箱内烘至恒重，室温放置24 h。称量发酵前后纤维袋的重量。DMD=(发酵前底物重量－发酵后底物重量)/发酵前底物重量×100%(2)1.4.3发酵常数发酵48 h取出发酵瓶，冰水浴终止发酵，将发酵瓶摇匀，开盖，采用UB-7 pH测定仪（美国）测定发酵液pH值。分别使用10 mL和15 mL离心管装上发酵液，15 mL离心管内的发酵液参照冯宗慈等[12]方法测定体外发酵的NH3-N浓度，10 mL离心管内的发酵液分别参照苏海涯[13]和Erwin等[14]方法测定MCP产量和VFA浓度。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2016软件进行整理，SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1试验各组产气参数（见表3）由表3可知，A组的快速降解部分产气量（a）显著低于其他组合（P0.05）；B组和C组的慢速降解部分产气量（b）以及潜在产气量（a+b）显著高于A组、C组和D组（P0.05）；A组的产气速率常数（c）显著高于其他组（P0.05）；C组的GP24 h显著高于其他组（P0.05）。J组的a值显著大于F组、G组和K组（P0.05）；J组的b和（a+b）值显著高于其他组（P0.05）；K组的c值显著大于其他组（P0.05）；J组的GP24 h显著高于F组、G组和K组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.002.T003表3试验各组产气参数精粗比项目a/mLb/mLa+b/mLc/(×10%/h)GP24 h/mL40∶60A组11.34b68.34c79.68c0.035a42.98cB组14.58a132.37a146.95a0.010c47.25bC组17.25a143.57a160.82a0.011c48.98aD组14.33a91.94b106.27b0.021b46.45bE组15.52a74.37c89.89c0.027b43.25cSEM0.6108.2658.5850.0020.651P值0.0090.0000.0000.0000.00030∶70F组11.39c70.24d81.64d0.033a42.71cG组13.83bc74.88d88.71d0.019c45.78bH组14.87ab88.04c102.91c0.022bc46.98abI组15.16ab112.15b127.31b0.012d48.05abJ组17.26a148.60a165.86a0.010d49.38aK组13.02bc70.98d84.00d0.027b42.98cSEM0.5286.9277.0500.0020.666P值0.0060.0000.0000.0000.001注∶同列数据同种精粗比肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2试验各组的发酵参数（见表4）由表4可知，C组的DMD显著高于A组和E组（P0.05）；C组的NH3-N、MCP浓度显著高于其他各组（P0.05）；C组的pH值显著低于其他组（P0.05）；J组的DMD显著高于F组和K组（P0.05）；J组的NH3-N、MCP浓度显著高于其他各组（P0.05）；J组的pH值显著低于除I组外的其他组（P0.05），F组、K组、G组、H组的pH值差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.002.T004表4试验各组的发酵参数精粗比项目DMD/%NH3-N/(mg/L)MCP/(g/L)pH值40∶60A组55.4b110.9d8.99e6.92aB组59.9a136.9b15.12b6.87bC组60.1a155.4a18.32a6.84cD组58.5ab136.3b14.39c6.89bE组56.4b124.4c10.62d6.90abSEM0.0063.970.8890.008P值0.0260.0000.0000.00030∶70F组55.9b126.5f15.29d6.83aG组59.6ab137.9d16.36c6.75aH组60.6ab185.2c17.49b6.74aI组61.6a198.4b17.84b6.53bJ组63.3a214.3a20.63a6.46bK组56.1b135.5e15.72d6.83aSEM0.0088.290.4340.037P值0.0350.0000.0000.0002.3试验各组体外发酵液VFA浓度（见表5）由表5可知，C组的乙酸浓度显著高于A组、D组和E组（P0.05），C组的丙酸浓度显著高于其他组（P0.05），B组的丁酸浓度显著高于A组、D组和E组（P0.05），B组的戊酸、异戊酸浓度显著高于A组、D组和E组（P0.05），B组和D组的异丁酸浓度显著高于A组、C组和E组（P0.05），C组的总挥发性脂肪酸浓度显著高于A组、D组和E组（P0.05），各组间的乙酸/丙酸值差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.002.T005表5试验各组体外发酵液VFA浓度精粗比项目乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)丁酸/(mmol/L)戊酸/(mmol/L)异戊酸/(mmol/L)异丁酸/(mmol/L)总挥发性脂肪酸/(mmol/L)乙酸/丙酸40∶60A组59.47b15.56b7.17b1.39d2.74c1.11c87.46c3.82B组70.54a17.66b10.18a1.91a3.54a2.32a106.16ab3.99C组75.25a20.93a8.68ab1.53cd2.83bc1.22c110.45a3.59D组61.09b16.66b8.44b1.77ab3.44ab2.43a93.84bc3.67E组61.69b16.18b7.19b1.62bc2.85bc1.79b91.33c3.83SEM1.9580.5770.3560.0540.1170.1532.8260.059P值0.0090.0030.0120.0030.0430.0000.0100.24430∶70F组52.75b13.47c6.67bc1.44b3.01a1.77b79.05b3.93G组59.96b16.01b7.67b1.13c1.90b2.10ab88.77b3.74H组57.74b14.58bc6.40c1.07c1.87b1.80b83.48b3.96I组56.60b15.34bc7.39bc0.99c2.14b2.15ab84.62b3.68J组72.51a18.40a9.36a2.03a3.55a2.33a108.17a3.94K组53.69b14.15bc6.41c1.13c1.99b1.85b79.23b3.80SEM1.8130.4470.2770.0910.1670.0642.6610.064P值0.0000.0020.0000.0000.0000.0260.0000.256当精粗比为30∶70时，J组的乙酸、丙酸、丁酸和戊酸浓度显著高于其他各组（P0.05），F组和J组的异戊酸浓度显著高于G组、H组、I组和K组（P0.05），J组的异丁酸浓度显著高于F组、H组和K组（P0.05），J组的总挥发性脂肪酸浓度显著高于其他各组（P0.05），各组间的乙酸/丙酸值差异不显著（P0.05）。3讨论3.1试验各组产气参数分析瘤胃发酵的GP主要源于发酵底物中的碳水化合物以及粗蛋白。GP含量能够反映发酵底物的可发酵程度、瘤胃微生物活性[15]，GP还可预测反刍动物的瘤胃消化率[16]。本试验中，当精粗比为40∶60、30∶70时，各组的GP、b以及a+b均随着苜蓿比例的增加呈先升后降的趋势，C组和J组的GP、b以及a+b分别显著高于A组、E组和F组、K组，说明C、WS、A之间存在正组合效应。Haddad[17]研究发现，豆科牧草在一定程度上可以提高秸秆的利用率，与本试验结论一致。本试验结果显示，E组和K组的GP、b以及a+b分别高于A组和F组，可能是A的可发酵程度高于WS；C组和J组的GP、b以及潜在产气量a+b最高，说明C∶WS∶A比为40∶30∶30和30∶10∶60时，发酵底物的可发酵性最高，瘤胃微生物的活性最高，改变产气规律，提高产气能力[18]。3.2各饲料组合的发酵指标pH值是评价瘤胃发酵水平的综合指标之一[19]。反刍动物的瘤胃液pH值通常在6~7，pH值太高或者太低均可影响瘤胃微生物的活性以及菌群的稳定性[20]，从而影响反刍动物消化率，降低动物生产性能。本试验中，各组的pH值范围为6.46~6.92，属于正常pH值范围。DMD代表动物的消化能力，也可衡量饲料的营养价值[21]。研究表明，DMD与GP具有一定的相关性，DMD越高，GP越高，反之GP越低[22]。本试验中，DMD的升降趋势与GP相同，与研究结果一致。本试验中，产生的NH3-N源于瘤胃微生物对人工混合瘤胃液中含氮物质的分解[23]，部分NH3-N继续合成为MCP，剩下的NH3-N溶解在人工混合瘤胃液中。合适的NH3-N浓度有利于瘤胃微生物的生长，提高活性，有利于MCP的合成，NH3-N浓度过高或者过低均会影响瘤胃环境的稳定性，影响动物的生产性能[24]。本试验中，各组的NH3-N浓度在110.9~214.3 mg/L，与Calsamiglia等[25]研究一致（63~275 mg/L）。MCP可以反映瘤胃微生物分解利用蛋白质和非蛋白氮的情况。MCP浓度与瘤胃微生物分解利用NH3-N的效率呈正相关[26]，也是反刍动物获取含氮物质的重要来源，为反刍动物小肠提供约1/2的可吸收蛋白[27]。本试验中，C组和J组的NH3-N浓度最高，说明在该组合下，瘤胃微生物分解瘤胃液中含氮物质的效率最高，C、WS、A之间产生正组合效应E组和K组的NH3-N浓度分别高于A组和F组，可能是因为E组和K组的粗蛋白含量较高，氮源丰富。各组的NH3-N浓度随着A比例的升高呈先升后降，与各组MCP浓度的趋势一致。发酵底物中的碳水化合物被瘤胃微生物分解生成VFA，VFA含量在一定程度上能够反映发酵底物中的碳水化合物的降解率以及瘤胃微生物活性。VFA在瘤胃中发挥着重要的作用，VFA为瘤胃微生物的生长繁殖提供大部分的能量以及碳源[28-29]，也是反映瘤胃环境稳定的重要指标[30]。研究表明，GP越高，TVFA浓度越高，反之TVFA浓度越低[31]。本试验中，各组的TVFA浓度变化趋势和GP变化趋势一致，与上述研究结果一致。TVFA浓度与pH值呈负相关[32]。本试验中，随着各组TVFA浓度的升高，对应的pH值开始降低，本试验结果与前人研究一致。本试验中，各组合乙酸/丙酸的值均在3.59~3.99，属于乙酸发酵型，利于提升反刍动物乳脂率。C组和J组的TVFA含量最高，说明在此比例组合下，发酵底物的降解率最高，瘤胃微生物活性最高。4结论本试验条件下，当C、WS、A的比例分别为40∶30∶30、30∶10∶60时，能够获得相对最佳的试验效果。