丁酸梭菌（Clostridium butyricum）属芽孢杆菌菌属，为革兰氏阳性，严格厌氧菌，适于动物肠道的无氧环境，增殖速度快，增殖倍率大；性质稳定，对环境抵抗力强，耐热、耐酸；代谢产物为丁酸、乙酸、乳酸以及少量的丙酸和甲酸，丁酸能够为肠道上皮细胞提供能量。丁酸梭菌或复合菌可改变肠道的菌群结构，抑制病原菌繁殖，促进有益菌生长，在机体血液代谢、免疫调节等方面发挥重要作用[1-3]；同时耐受性强，可在饲料制粒以及胃液消化过程中大量存活，是一种绿色环境友好型的饲料添加剂。目前关于笼养和散养饲养模式下基础日粮中添加复合益生菌对广西三黄鸡肠道形态与菌群的影响相关报道较少，无实际规模化生产中应用的研究数据。本试验在一定规模的广西三黄鸡养殖基础上，研究不同饲养模式添加复合益生菌对广西三黄鸡肠道形态与菌群的影响，为广西三黄鸡在同日龄不同饲养模式下添加复合益生菌实际生产中应用效果提供参考。1材料与方法1.1试验材料添加剂：丁酸梭菌（Clostridium butyricum）（活菌数：丁酸梭菌≥1×109 CFU/g），购自湖北蓝谷中微生物技术有限公司。复合菌：枯草芽孢杆菌（Clostridium butyricum）（活菌数≥4.5×109 CFU/g）+丁酸梭菌（活菌数≥2.0×108 CFU/g），购自北京科为博生物科技有限公司。1.2试验动物及日粮试验选用国家畜禽新品种（配套系）认定的广西三黄鸡。参照NRC（1994）《家禽营养标准》[4]营养需要的基础上，根据黄鸡的品种特性、饲养管理和营养需求进行调整，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.011.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成/%含量营养水平合计100.0玉米68.5粗蛋白17.20豆粕15.8粗脂肪4.50玉米酒精糟3.0粗纤维3.00玉米蛋白粉2.5粗灰分5.00猪油1.6蛋氨酸0.72石粉1.7赖氨酸0.60花生麸1.5食盐0.50棉粕1.0总磷0.60棕榈粕1.0钙1.20磷酸氢钙0.7代谢能/(MJ/kg)12.42膨润土0.7预混料2.0注：1.每千克预混料为日粮提供：Fe[按Fe2(SO4)3计] 100 mg、Cu（按CuSO4计）8 mg、Mn（按MnSO4计）80 mg、I（按Ca(IO3)2计）0.5 mg、Se（按Na2SeO3计）0.2 mg、VA 12 000 IU、VD3 2 200 IU、VE 30 IU、VB1 2 mg、VB2 5 mg、VB6 1.5 mg、VB12 0.03 mg、叶酸1.25 mg、烟酸40 mg、D-泛酸10 mg、生物素0.36 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.3试验设计选取49日龄广西三黄鸡33 000只（公、母各半）分笼养和散养开展试验。试验期30 d。笼养模式选取3 000只随机分成3个组，即LA组：基础日粮+丁酸梭菌组（添加量500 g/t）；LB组：基础日粮+复合益生菌组（添加量1 000 g/t）；LC组：基础日粮（空白对照组）。每组1 000只鸡，每组5个重复，每个重复200只（公、母各半）。散养模式选取30 000只随机分成3组，即SA组：丁酸梭菌（添加量500 g/t）；SB组：复合益生菌组（添加量1 000 g/t）；SC：空白对照组，每组10 000只，每组5个重复，每个重复2 000只（公、母各半）。每个重复中挑选3只体况相近、健康状况良好的广西三黄鸡共15只，进行屠宰取样，试验分组见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.011.T002表2试验分组养殖模式日粮处理笼养模式LA：基础日粮+丁酸梭菌LB：基础日粮+复合益生菌LC：基础日粮散养模式SA：基础日粮+丁酸梭菌SB：基础日粮+复合益生菌SC：基础日粮试验前测量笼子的面积与投入鸡数目计算笼养密度，即13只/m2。按笼养密度圈量散养鸡舍面积为2 310 m2。使得笼养和散养的饲养密度相同，试验前对鸡笼、鸡舍及运动场进行清洗消毒晾置。随机分组试验，每日8：00和17：00按时按量各饲喂1次，自由饮水。每日定时记录舍内温湿度、粪便情况，每隔1周清理一次粪便。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验开始前和试验结束前，笼养每个重复组随机抽取100只，散养每个重复组各抽称1 000只空腹称重（称重前停饲12 h）记录为初重和末重。各组数值由每组重复组的平均值计算。平均日采食量为广西三黄鸡采用限饲饲养，投料之后很快被采食干净，本试验每日采食量的计算以每日投料量计算。平均日增重=(末重－初重)/试验天数(1)平均日采食量=总采食量/试验天数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.4.2肠道形态与肠道菌群试验共屠宰90只，试验结束前12 h停喂，每组重复随机组选取15只体重、健康状况相近的试验鸡，逐个称重得到宰前活重。鸡颈部放血处死，迅速打开腹腔，分别采集十二指肠、空肠、回肠各肠段2~3 cm，10%多聚甲醛溶液固定。肠道形态测定：在未经挤压的状况下取每个肠段同一位置的十二指肠（肌胃连接十二指肠后端3 cm左右）、空肠（十二指肠与空肠连接处后10 cm处）、回肠（空肠与回肠总体肠段后3/5处）各2 cm，生理盐水轻轻冲洗，放入多聚甲醛溶液中常温保存，固定24 h以上将肠段从固定液取出，目标部位组织修平整，梯度乙醇脱水后浸蜡，浸好蜡的组织包埋并制作切片，分别进行苏木精染色和伊红染色，封片，在显微镜下观察并采图。肠道菌群测定：打开腹腔后迅速用无菌解剖刀取出盲肠，无菌手术刀挖取盲肠中段内容物，取50~100 mg放入2.0 mL无菌离心管中，-80 ℃保存，以高通量测序检测肠道菌群。1.5数据整理与分析试验数据采用Excel 2013进行初步整理，SPSS 22.0软件单因素方差分析，Duncan's法多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，以P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同饲养模式添加复合益生菌对广西三黄鸡生长性能的影响（见表3）由表3可知，不同饲养模式下，三黄鸡的各项指标差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.011.T003表3不同饲养模式添加复合益生菌对广西三黄鸡生长性能的影响项目初重/g末重/g日均采食量/[g/(只·d)]平均日增重/[g/(只·d)]料重比LA组571.341 235.796221.432.89LB组576.521 231.5521.132.93LC组577.271 180.5719.463.19SA组571.341 139.236218.323.38SB组576.521 129.4017.833.48SC组577.271 117.9017.443.56SEM1.833.28—1.150.15P值0.247 00.550 0—0.343 20.071 0注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。笼养模式下，与LC组相比，LA组和LB组的平均末重分别提高4.88%和4.32%，日增重分别提高10.12%和8.58%，料重比分别降低9.40%和8.15%，说明笼养模式下日粮中添加LA和LB的广西三黄鸡的生长性能呈升高的趋势。散养模式下，日粮中添加LA和LB对广西三黄鸡的生长性能的影响均不显著（P0.05），但也呈提高的趋势。2.2不同饲养模式添加复合益生菌对广西三黄鸡肠道形态的影响2.2.1笼养模式下添加复合益生菌对广西三黄鸡肠道形态的影响（见表4）由表4可知，笼养至80 d，各组十二指肠、回肠的绒毛高度、隐窝深度、绒隐比差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.011.T004表4笼养模式下添加复合益生菌对广西三黄鸡肠道形态的影响组别日龄十二指肠空肠回肠绒毛高度/mm隐窝深度/mm绒隐比绒毛高度/mm隐窝深度/mm绒隐比绒毛高度/mm隐窝深度/mm绒隐比LA组49 d1.720.208.361.06abc0.17ab6.270.450.152.98LB组1.460.227.370.95bc0.17ab6.390.640.154.27LC组1.390.187.720.80c0.14b5.680.570.163.50LA组80 d1.830.218.581.23ab0.17ab7.220.620.135.04LB组1.760.228.161.28a0.16ab8.150.660.164.18LC组1.670.198.691.19ab0.21a5.810.570.144.07SEM0.130.030.800.070.020.960.100.020.57P值0.2020.9070.8370.0020.370.4790.7050.8450.24780 d的LB组三黄鸡空肠绒毛高度显著高于49 d的LB组、LC组（P0.05）；80 d各组三黄鸡隐窝深度差异不显著（P0.05），与49 d的LA组、LB组相比差异样不显著（P0.05）。2.2.2散养模式下添加复合益生菌对广西三黄鸡肠道形态的影响（见表5）由表5可知，散养至80 d，各组三黄鸡十二指肠的绒毛高度、隐窝深度、绒隐比差异均不显著（P0.05）。80 d的SB组三黄鸡空肠绒毛高度显著高于49 d的SB组、SC组（P0.05）；80 d的SC组三黄鸡空肠隐窝深度均显著高于49 d的SC组（P0.05）。80 d时，各组三黄鸡空肠、回肠的绒毛高度、隐窝深度、绒隐比差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.011.T005表5散养模式下添加复合益生菌对广西三黄鸡肠道形态的影响组别日龄十二指肠空肠回肠绒毛高度/mm隐窝深度/mm绒隐比绒毛高度/mm隐窝深度/mm绒隐比/mm绒毛高度/mm隐窝深度/mm绒隐比SA组49 d1.720.208.361.06abc0.17ab6.270.450.152.98SB组1.460.227.370.95bc0.17ab6.390.640.154.27SC组1.390.187.720.80c0.14b5.680.570.163.50SA组80 d1.690.247.221.40ab0.25ab5.840.720.194.03SB组1.730.257.361.55a0.24ab6.630.740.193.85SC组1.520.255.941.23abc0.32a4.260.670.223.07SEM0.160.031.080.120.041.010.090.020.49P值0.5550.5570.7380.0070.0290.6210.2470.2460.3822.3不同饲养模式添加复合益生菌对广西三黄鸡盲肠菌群的影响2.3.1不同饲养模式下添加复合益生菌广西三黄鸡盲肠菌群在门水平上的分布（见表6）由表6可知，笼养模式下，LA组的厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度显著高于LB组和LC组（P0.05），拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度显著低于LB组和LC组（P0.05）；LA组和LB组的放线菌门（Actinobacteria）相对丰度显著高于LC组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.011.T006表6不同饲养模式下添加复合益生菌广西三黄鸡盲肠菌群在门水平上的分布项目FirmicutesBacteroidetesProteobacteriaActinobacteriaLA组51.46c42.04b1.123.27aLB组39.53d52.17a1.093.03aLC组36.64d59.10a1.151.03bSA组57.67a38.84c1.350.90bSB组53.48b43.45b1.280.59cSC组52.22b43.92b1.520.66cSEM2.822.080.040.12P值0.060.030.140.32散养模式下，SA组的Firmicutes相对丰度显著高于SB组和SC组（P0.05），Bacteroidetes相对丰度低于SB组和SC组（P0.05）。散养模式各组的Firmicutes的相对丰度均高于笼养模式各组，散养模式LB组、LC组Bacteroidetes和Actinobacteria的相对丰度均显著低于笼养模式LB组、LC组（P0.05）。笼养、散养模式各组三黄鸡变形菌门（Proteobacteria）相对丰度差异不显著（P0.05）。2.3.2不同饲养模式下添加复合益生菌广西三黄鸡盲肠菌群在属水平上的分布（见表7）由表7可知，笼养模式下，80 d时LA组三黄鸡的另枝菌属（Alistipes）显著低于LB组和LC组（P0.05）；LA组和LB组梭菌属（Clostridium）显著高于LC组（P0.05）；LA组的瘤胃球菌属（Ruminococcus）显著高于其他两组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.011.T007表7不同饲养模式下添加复合益生菌广西三黄鸡盲肠菌群在属水平上的分布项目UnclassifiedBacteroidesAlistipesLactobacillusClostridiumRuminococcusLA组26.25c21.764.98b3.52a6.13a4.79aLB组26.74c26.169.23a1.09b6.46a1.73bLC组36.10a21.2211.61a2.76a4.32b1.34bSA组32.68b17.11b3.27b6.79a6.46a8.54aSB组40.52a16.75b3.89b3.78b5.73a3.03bSC组32.56b21.60a4.88a7.99a4.18b4.27bSEM3.362.580.620.440.560.38P值0.0310.0230.0420.0350.0080.045散养模式下，80 d时SA组三黄鸡的Ruminococcus相对丰度显著高于SB组、SC组（P0.05）；SA组、SB组Bacteroides和Alistipes相对丰度显著低于SC组（P0.05），Clostridium相对丰度显著高于SC组（P0.05）；SB组Unclassified相对丰度显著高于其他两组，乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度低于其他两组（P0.05）。散养模式下，LA组、LB组三黄鸡拟杆菌属（Bacteroides）均显著低于笼养模式下LA组、LB组（P0.05），而散养模式与笼养模式LA组、LB组、SA组、SB组梭菌属（Clostridium）差异不显著（P0.05）。3讨论3.1不同饲养模式下添加复合益生菌对广西三黄鸡生长性能的影响笼养鸡在生长速度、平均日增重、平均采食量和料肉比以及成活率方面优于散养鸡[5-6]，但无显著差异。有研究表明，笼养鸡胃肠道的相对体质量指数和肠道长度均比地面平养组高，说明笼养鸡具有更好的消化率[7]。丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌能够提高肉鸡的生长性能，降低死淘率[8-13]，可能是因为丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌能够分泌多种活性酶、抗菌肽、短链脂肪酸等物质，改善肠道的微生态环境，提高机体的免疫力[14-17]。本试验发现，散养模式下日粮中添加丁酸梭菌和复合菌对广西三黄鸡的生长性能无显著影响，但呈提高趋势，可能仍然与限饲有关。与笼养模式相比，散养鸡生长性能均低于笼养水平，因为散养鸡本身运动量比笼养鸡大，限饲会导致能量供给不足。笼养模式下，鸡活动量少，能量损耗较少；散养鸡运动量大，造成能量浪费，引起生长性能差异。日粮中添加复合益生菌，大量的活菌进入动物肠道内后在提高饲料消化率的同时与宿主争夺营养，有可能在营养供给不足的情况下导致生长性能之间的差异不显著。单一笼养条件下，益生菌对三黄鸡的促生长效应无显著影响。3.2不同饲养模式下添加复合益生菌对广西三黄鸡肠道形态的影响丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌可通过代谢产物，增强肠道的抗炎能力，促进肠道上皮细胞的发育和修复[18-20]。日粮中添加丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌能够显著提高鸡各肠段的绒毛高度和绒/隐比[21-22]。本次试验发现，笼养或散养模式下日粮中添加复合益生菌能够提高广西三黄鸡空肠绒毛高度。80 d笼养各组隐窝深度与49 d的LA组、LB组相比差异同样不显著。80 d散养SC组空肠隐窝深度均显著高于49 d的SC组。与丁酸梭菌相比，复合益生菌改善肠道的效果更好，芽孢杆菌通过刺激细胞因子、趋化因子和紧密连接蛋白的产生促进肠道健康，从而对提高鸡的生长速度有利[23-24]。散养的广西三黄鸡肠道形态比笼养差，可能与肠道相关疾病有关，散养模式下鸡生长环境较粗糙，存在隐患[25]，导致散养广西三黄鸡在肠道形态上逊于笼养鸡。3.3不同饲养模式下添加复合益生菌对广西三黄鸡肠道菌群的影响肠道微生物群在动物健康和生产性能中起重要作用。最佳微生物群可以防止病原体在肠道上皮细胞中定植，调节肠道相关的全身免疫，影响胃肠道发育[26-27]。丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌均具有维持肠道菌群平衡的作用[28-32]，不同养殖模式肠道菌群相对丰度不同[33]。盲肠是鸡微生物菌群最丰富的肠段[34]。本试验发现，笼养或散养模式下，相比LB组，LA组三黄鸡的厚壁菌门、瘤胃球菌属显著上调。散养模式LB组拟杆菌门和放线菌门、LA组、LB组拟杆菌属相对丰度显著低于笼养模式。与散养模式对比，笼养模式广西三黄鸡的有益菌相对丰度上调，因为散养后饲养环境多样化影响肠道菌群的适应性。综合散养和笼养模式，对于改善广西三黄鸡盲肠微生物区系添加丁酸梭菌效果更好。4结论笼养或散养模式下，日粮中添加丁酸梭菌、复合益生菌对广西三黄鸡的生长性能无明显影响，但添加复合益生菌可以促进空肠形态发育，添加丁酸梭菌有助于提高肠道有益菌相对丰度。笼养模式的生长性能、肠道形态以及菌群相对丰度优于散养模式。