目前，中草药饲料添加剂开发和利用已成为热点研究方向。中草药提取的多糖类多具有调节免疫的作用，本课题组前期研究发现，大枣多糖作为饲料添加剂能够提高黄羽肉鸡种鸡的免疫功能[1]。孙甜甜[2]研究发现，枸杞多糖作为饲料添加剂能够提高肉仔鸡的免疫功能。马璐等[3]研究发现，甘草多糖能够提高肉仔鸡的免疫功能。方磊涵等[4]研究发现，利用12味中药提取的多糖作为饲料添加剂能够提高肉仔鸡的免疫功能。陈家磊等[5]研究发现，车前草多糖能够提高疫苗抗体效价，提高肉鸡免疫功能。但银杏多糖作为饲料添加剂的研究鲜有报道。银杏多糖资源丰富，银杏叶、银杏外种皮和银杏白果均能够提取银杏多糖，在鸡生产中应用将具有广泛的应用前景。本试验使用银杏叶提取的银杏多糖作为饲料添加剂，探讨银杏多糖对蛋鸡免疫功能的影响，为银杏多糖在蛋鸡养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1基础日粮产蛋期配合饲料（产品标准编号O/DHNJ）由大成农技（葫芦岛）有限公司生产。原料：玉米、豆粕、棉籽粕、鱼粉、碳酸氢钙、石粉、氯化钠、氯化胆碱、微量元素、维生素和功能性氨基酸。日粮营养水平：粗蛋白含量≥16.0%、粗纤维含量≤7.0%、粗灰分含量≤13.0%、钙含量3.0%~4.2%、总磷含量≥0.5%、氯化钠含量0.3%~0.8%、赖氨酸含量≥0.9%、蛋氨酸含量0.42%~0.89%、水分含量≤14.0%。1.1.2主要试剂银杏多糖（纯度≥90%，晨光生物技术有限公司）。鸡干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、外周血淋巴细胞分离液试剂盒及RPMI-1640培养液、胎牛血清、MTT四甲基偶氮唑盐、盐酸左旋咪唑（北京索莱宝科技有限公司）。TaKaRa逆转录试剂盒、TB Green™ Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒（宝生物工程有限公司）；Trizol、Geletcin、marke、50x TAE、Invitrogen（碧云天生物技术有限公司）；鸡新城疫病毒血凝抑制试验（HI）抗原（中国兽医药品监察所）。1.2试验设计在锦州医科大学生产经营公司进行试验。宫廷黄鸡按常规免疫程序进行接种，笼养，自由采食。选用120日龄宫廷黄鸡母鸡450只，分为5组，每组3个重复，设ZXMZ组（添加0.2 g/kg盐酸左旋咪唑）、YXDT0组、YXDT1组、YXDT2组和YXDT4组（分别添加0、1、2和4 g/kg银杏多糖）。试验期80 d。1.3测定指标及方法1.3.1NDV抗体效价200日龄时，各组随机抽取20只鸡静脉采血1 mL，分离血清，采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验检测NDV抗体效价[6-9]。1.3.2IFN-γ、IL-2和IL-4含量200日龄时，各组随机抽取5只鸡静脉采血1 mL，分离血清，采用IFN-γ、IL-2和IL-4 ELISA检测试剂盒检测IFN-γ、IL-2和IL-4含量，每组3个重复[10-12]。1.3.3淋巴细胞IFN-γ、IL-2和IL-4 mRNA相对表达量200日龄时，各组随机抽取5只鸡静脉采血1 mL，分离淋巴细胞，制备淋巴细胞悬液，采用qRT-PCR法检测IFN-γ、IL-2和IL-4 mRNA相对表达量[13-16]。1.3.4脾组织切片的观察200日龄时，各组随机抽取5只鸡取脾，10%甲醛溶液固定，石蜡切片，苏木精伊红（HE）染色。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 17.0进行方差分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，以P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1银杏多糖对蛋鸡NDV抗体效价的影响（见表2）由表2可知，与YXDT0组相比，其余各组蛋鸡的NDV抗体效价极显著升高（P0.01），其中YXDT4组最高，极显著高于YXDT0组、ZXMZ组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.010.T001表2银杏多糖对蛋鸡NDV抗体效价的影响项目YXDT0组ZXMZ组YXDT1组YXDT2组YXDT4组NDV抗体效价6.95±0.83Cc8.50±0.61Bb8.85±0.67ABab9.05±0.76ABa9.10±0.64Aa注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。lg22.2银杏多糖对蛋鸡IFN-γ、IL-2和IL-4的含量的影响（见表3）由表3可知，与YXDT0组相比，除YXDT1组外其余各组蛋鸡血清IFN-γ含量均极显著增加（P0.01）。YXDT4组显著高于ZXMZ组（P0.05）。表明银杏多糖能够提高IFN-γ的含量，在试验浓度范围内，IFN-γ的分泌随着银杏多糖浓度升高增多，以YXDT4组效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.010.T002表3银杏多糖对鸡IFN-γ、IL-2和IL-4的含量的影响项目YXDT0组ZXMZ组YXDT1组YXDT2组YXDT4组IFN-γ11.63±2.21Bc16.56±1.03Ab11.96±0.68Bc17.01±1.04Ab19.61±0.35AaIL-235.60±1.91Bc49.16±3.55Aab51.70±3.10Aa45.15±3.69Ab44.32±2.98AbIL-432.56±6.59Bc48.25±3.80Aab52.83±5.45Aa41.70±1.95ABb36.76±1.91Bbcng/L与YXDT0组相比，其余各组蛋鸡血清IL-2含量极显著升高（P0.01）；YXDT1组显著高于YXDT2组和YXDT4组（P0.05）。除YXDT4组外，其余各组IL-4含量均极显著高于YXDT0组（P0.01）；YXDT1组极显著高于YXDT4组（P0.01），显著高于YXDT2组（P0.05）。表明银杏多糖能够提高IL-4、IL-2的含量，在试验浓度范围内，IL-4、IL-2的分泌随着银杏多糖浓度升高而降低，以YXDT1组效果最佳。2.3银杏多糖对蛋鸡IFN-γ、IL-2和IL-4 mRNA相对表达量的影响（见表4、图1~图3）由表4可知，与YXDT0组相比，YXDT4组蛋鸡血清IFN-γ mRNA相对表达量极显著升高（P0.01），ZXMZ组、YXDT2组显著升高（P0.05）；YXDT4组极显著高于YXDT1组（P0.01），显著高于YXDT2组（P0.05）。与YXDT0组相比，ZXMZ组、YXDT1组和YXDT2组蛋鸡血清的IL-2 mRNA相对表达量均极显著升高（P0.01），YXDT4组显著升高（P0.05）。与YXDT0组相比，ZXMZ组、YXDT1组和YXDT2组蛋鸡血清的IL-4 mRNA相对表达量均极显著升高（P0.01），YXDT4组显著升高（P0.05）。YXDT1组显著高于YXDT4组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.010.T003表4银杏多糖对鸡IFN-γ、IL-2和IL-4 mRNA相对表达量的影响项目YXDT0组ZXMZ组YXDT1组YXDT2组YXDT4组IFN-γ mRNA30.39±0.56Bc31.69±0.63ABb30.73±0.26Bc31.81±0.45ABb32.83±0.49AaIL-2 mRNA29.68±0.32Cd32.54±0.13ABb33.32±0.27Aa31.88±0.25Bb30.51±0.73CcIL-4 mRNA29.08±1.28Bc32.79±0.60Aa33.17±0.65Aa31.82±1.04Aab30.01±0.86ABb由图1~图3可知，在试验浓度范围内，随着银杏多糖浓度升高，IFN-γ mRNA相对表达量升高，以YXDT4组效果最佳；IL-2 mRNA、IL-4 mRNA相对表达量降低，以YXDT1组效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.010.F001图1IFN-γ mRNA电泳结果注：1为ACTB组（marker）；2为YXDT0组；3为ZXMZ组；4为YXDT1组；5为YXDT2组；6为YXDT4组；7为YXDT0组；8为ZXMZ组；9为YXDT1组；10为YXDT2组；11为YXDT4组；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.010.F002图2IL-2 mRNA电泳图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.010.F003图3IL-4 mRNA电泳图谱2.4银杏多糖对蛋鸡脾组织结构的影响（见图4）由图4可知，与YXDT0组相比，ZXMZ组、YXDT1组、YXDT2组和YXDT4组蛋鸡脾小结淋巴细胞增大，细胞数量增多，动脉周围淋巴鞘增厚。ZXMZ组、YXDT1组和YXDT2组蛋鸡白髓与红髓界限明显。ZXMZ组、YXDT1组和YXDT2组蛋鸡脾小结淋巴细胞增大，细胞数量增多，动脉周围淋巴鞘增厚，白髓与红髓界限明显程度优于YXDT4组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.010.F004图4蛋鸡脾组织结构注：YXDT2组、YXDT4组扩大倍数为400×，组织切片长为20 μm。3讨论淋巴细胞是免疫活性细胞，分为大、中、小共3种。骨髓、淋巴结和脾的生发中心静止的淋巴母细胞在抗原刺激下分化为大淋巴细胞，经过几次分裂形成小淋巴细胞。小淋巴细胞分为B细胞、T细胞、K细胞和NK细胞。禽类B细胞由腔上囊分化，在抗原刺激下分化为浆细胞，产生抗体，参与体液免疫。T细胞由胸腺分化而来，与靶细胞特异性结合，破坏靶直接杀伤靶细胞；释放淋巴因子，最终扩大并增强免疫效应，参与细胞免疫[17]。金鑫等[18]研究体外分离脾淋巴细胞发现，银杏多糖能够促进脾淋巴细胞增殖，细胞周期由G1期进入S期，细胞因子分泌及mＲNA表达。孟秀彦等[19]研究发现，以银杏叶多糖为佐剂能够提高传染性法氏囊超强毒灭活疫苗的疫免提效果。余建国等[20-21]研究发现，利用1日龄AA鸡，腹腔注射银杏多糖能够降低马立克强毒感染雏鸡的发病率和死亡率，促进脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌。本研究表明，银杏多糖能够促进NDV抗体产生，提高血液中IFN-γ、IL-2和IL-4的含量及其mRNA相对表达量，表明银杏多糖能够促进B细胞产生抗体，实现体液免疫，促进T细胞分泌细胞因子，实现细胞免疫。脾的组织结构脾小结主要是B细胞，动脉周围淋巴鞘主要是T细胞。银杏多糖能够促进脾小结淋巴细胞增大，细胞数量增多，白髓与红髓界限明显，促进B细胞增殖和分化，实现体液免疫。动脉周围淋巴鞘增厚，促进T细胞增殖，实现体液免疫。银杏多糖能够提高IL-2和IL-4的分泌量及mRNA相对表达量，在试验浓度范围内，随着银杏多糖浓度的升高，IL-2和IL-4的分泌量及mRNA相对表达量而降低，说明银杏多糖添加浓度偏高，相对最佳浓度的选择需要进一步试验筛选。4结论银杏多糖能够促进血清中NDV抗体的产生，细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4的分泌及其mRNA的表达，促进脾淋巴细胞的增殖，从而提高机体的体液免疫和细胞免疫功能。