菊糖（Inulin）是提取自菊科植物的多糖，由果糖以β-(2,1)-糖苷键连接[1]。菊糖除应用于食品工业和医药工业外，在动物养殖中也有应用[1-2]。菊糖应用在动物养殖可促进肠道有益活性微生物繁殖[3-4]，促进营养成分吸收，提高抗病能力等[5-6]。王亚锴[7]研究表明，在肉仔鸡饲料中添加适量的菊糖可以促进体内益生菌的生长繁殖，促进营养成分的吸收利用，加快肉仔鸡生长。张雷等[8]发现，在饲料中添加化一定浓度的低聚果糖或菊粉糖可以增强哺乳母猪及仔猪的免疫功能。李海英等[9]研究发现，在肉仔鸡饲料中添入加1%的菊糖，肉仔鸡的抗病效果与饲用抗生素相同。在肉仔鸡饲养过程中投喂适量的菊糖，对肠道益生菌的生长起显著的促进作用，降低肉仔鸡排泄物和肠道臭气化合物产生量；在饲料中添加菊糖能够大幅度提高消化酶活性，提高非特异性免疫功能[10-12]。胡丹丹等[13]研究发现，菊糖可增加奶牛瘤胃中纤维降解菌属，促进奶牛对饲粮的吸收利用。Claus等[14]研究发现，菊糖无法被动物自身酶蛋白降解，动物体内益生菌可分解利用菊糖，产生的产物能够改变肠道酸碱平衡，防止有害菌的生长繁殖，提高动物免疫力。王水旺等[15]研究表明，在断奶羔羊饲料中添加一定量的菊芋粕能够显著增加羔羊对饲料营养成分的吸收率；饲喂60 d后，与对照组相比，羔羊的体量、体高、体长等指标明显增加。谢瑞祺等[16]在蛋鸡饲粮中添加适量的海藻粉和菊粉，结果发现，海藻粉和菊粉能够明显提升蛋鸡产蛋数量，提高鸡蛋的血清抗氧化性。菊糖主要从菊苣和菊芋等菊科植物中提取，也可以蔗糖为底物，通过微生物来源地菊糖蔗糖酶催化合成。目前，已有能够分泌菊糖蔗糖酶的微生物和催化合成菊糖的相关报道[17-21]，但报道的菊糖蔗糖酶酶活性低，稳定性和活性容易受到温度、pH值和其他因素的影响，难以工业化生产。固定化酶技术为提供菊糖蔗糖酶稳定性提供有效的方法。以海藻酸钠为载体的包埋法因不会对酶结构产生影响，且回收率高、成本低而成为酶固定化最常用的方法之一[22-23]。本试验以菊糖蔗糖酶酶活为考察指标，通过单因素试验及响应面试验对海藻酸钠包埋固定菊糖蔗糖酶的条件进行优化，旨在提高菊糖蔗糖酶的酶学性质，为菊糖酶法合成提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌株和试剂光滑假丝酵母SLLSM3由广西科技师范学院广西糖资源工程技术研究中心筛选。葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻酸钠（SA）、氯化钙（CaCl2）购自国药集团化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸（DNS）、戊二醛（GA）购自合肥博美生物科技有限责任公司。1.1.2培养基产酶培养基参考文献[24]进行。1.2仪器设备UPG-762双光束紫外分光光度计（北京优谱通用科技有限公司）、HH-8恒温水浴锅（常州市凯航仪器有限公司）、MP512 PH计（上海三信仪表厂）、FLY-211B摇床（上海申贤恒温设备厂）。1.3测定指标及方法1.3.1粗酶的制备将活化后的光滑假丝酵母SLLSM3，接种于37 ℃ 180 r/min摇床中培养96 h，使用硫酸铵盐析法进行初步纯化，浓缩，制得菊糖蔗糖酶粗酶液，存4 ℃保存。1.3.2固定化酶的制备参考文献[25]-文献[27]进行修改，固定化菊糖蔗糖酶的制备条件：将菊糖蔗糖粗酶液与海藻酸钠溶液按1∶3（体积比）混合，搅拌均匀。使用1 mL无菌注射器将上述混合液加入预冷的氯化钙溶液，形成尺寸约3 mm的固定化酶颗粒，4 ℃静置，使用pH值6.0的磷酸缓冲液洗涤3次，纯净水洗涤3次凝胶颗粒，加入戊二醛溶液，30 ℃交联一定时间，分别使用磷酸缓冲液和纯净水洗涤凝胶颗粒，于磷酸缓冲液中4 ℃冰箱中保存。1.3.3试验设计初始固定化条件为：SA 2.5%、CaCl2 4.0%、硬化时间3.0 h、GA 0.035%、交联30 min。单因素试验：采用控制变量法，以菊糖蔗糖酶相对酶活为考察指标，考察海藻酸钠浓度（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、CaCl2浓度（2%、3%、4%、5%、6%）、固定化时间（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h）、戊二醛浓度（0.025%、0.030%、0.035%、0.040%、0.045%）和交联时间（20、30、40、50、60 min）5个因素对固定化酶相对酶活的影响。以菊糖蔗糖酶酶活为考察指标，对SA浓度（A）、CaCl2浓度（B）、固定化时间（C）进行响应面试验设计，响应面因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.T001表1响应面因素水平设计因素水平A/%B/%C/h-12.03.02.502.54.03.013.05.03.51.3.4固定化菊糖蔗糖酶酶学性质试验固定化菊糖蔗糖酶酶学性质试验参考文献[28]进行，略有改动。1.3.5菊糖蔗糖酶酶活测定参考文献[18]-文献[20]测定酶活，略有修改。本试验检测的酶活为总酶活。反应体系中葡萄糖含量的检测参考DNS法[29]进行。固定化酶活性的测定[24]：以1.0 g固定化酶代替1.0 mL游离酶，酶促反应30 min，取出固定化酶颗粒终止反应，以添加1.0 g用灭活酶制作的固定化酶颗粒为空白对照。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1海藻酸钠浓度对固定化菊糖蔗糖酶相对酶活的影响（见图1）由图1可知，当海藻酸钠浓度为2.5%时相对酶活性最高。海藻酸钠浓度过低或过高均对酶的固定化效果产生影响[30]。因海藻酸钠分子与钙离子发生交联形成固态颗粒，浓度低，反应形成的颗粒缝隙大，菊糖蔗糖酶结合不牢、易脱落；浓度高，酶蛋白扩散不均匀，形成颗粒大小不一[24,31-32]，影响菊糖蔗糖酶与底物接触，酶活性降低。因此，选择海藻酸钠浓度为2.5%进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.F001图1海藻酸钠浓度对固定化菊糖蔗糖酶相对酶活的影响2.1.2氯化钙浓度对固定化酶菊糖蔗糖酶相对酶活的影响（见图2）由图2可知，当CaCl2浓度为4%时，菊糖蔗糖酶相对酶活最高。因为CaCl2浓度影响到凝胶颗粒的机械强度，Ca2+浓度低，交联度低，机械强度差，酶分子容易流失到溶液中；Ca2+浓度高，交联大，凝胶颗粒透过性差，酶分子不容易进入，酶与底物难结合，酶活性低[24,33]。因此，本试验选择CaCl2浓度4%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.F002图 2氯化钙浓度对固定化菊糖蔗糖酶相对酶活的影响2.1.3固定化时间对固定化菊糖蔗糖酶相对酶活的影响（见图3）由图3可知，当固定化时间为3.0 h时，菊糖蔗糖酶的相对酶活性最大。因为固定化时间不足，反应不充分，凝胶网络结构形成不完全，直径较大，酶分子容易流失；固定化时间过长，导致交联过度，颗粒网状结构过于紧密、孔径小，底物难以与酶结合，相对酶活降低[32,34]。因此，本试验选择固定化时间为3.0 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.F003图 3固定化时间对固定化菊糖蔗糖酶相对酶活的影响2.1.4戊二醛浓度对固定化菊糖蔗糖酶相对酶活的影响（见图4）由图4可知，当戊二醛浓度为0.035%时，相对酶活性最高；当戊二醛浓度继续增加时，相对酶活性显著下降，可能因为戊二醛浓度过低时，大部分酶分子未能与交联剂反应，洗脱时脱落；高浓度的戊二醛溶液会使酶分子变性，同时也会固定过多的酶分子，颗粒网络缝隙过小，底物分子不容易接触反应，导致丧失酶活性[33,35]。因此本试验选择戊二醛浓度为0.035%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.F004图4戊二醛浓度对固定化菊糖蔗糖酶相对酶活的影响2.1.5交联时间对固定化菊糖蔗糖酶相对酶活的影响（见图5）由图5可知，菊糖蔗糖酶活性在反应时间30 min 时达到峰值；交联时间延长，相对酶活下降。原因是交联时间短，戊二醛未充分扩散到颗粒内部，与菊糖蔗糖酶分子结合不充分，酶活低；交联时间长，海藻酸钠凝胶结合位点达到饱和，颗粒网络结构过于紧密，导致酶活性降低[33]。因此，本试验选择交联时间为40 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.F005图5交联时间对固定化菊糖蔗糖酶相对酶活的影响2.2响应面和方差分析结果（见表2、表3）自变量与固定化菊糖蔗糖酶酶活（Y1）的回归方程为：Y1=70.55+4.86A-1.36B+1.79C-0.89AB-0.35AC-1.68BC-5.28A2-4.66B2-5.18C210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.T002表2响应面试验结果试验号ABCY1/(U/g)11-1067.8720-1-158.723-10157.654-1-1056.11501159.37610166.39700069.48801-159.389-11055.141011063.361100070.181200071.6813-10-153.121410-163.241500071.32160-1165.411700070.11由表3可知，回归模型P0.01，方程模型达到极显著，失拟项P0.05，差异不显著；模型可用菊糖蔗糖酶固定化条件分析及预测。各因素对固定化菊糖蔗糖酶的酶活影响排序为ACB，即海藻酸钠浓度固定化时间CaCl2浓度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性模型602.99967.00129.260.000 1**A188.571188.57363.810.000 1**B14.74114.7428.440.001 1**C25.78125.7849.730.000 2**AB3.1313.136.040.043 6*AC0.4810.480.920.369 8BC11.22111.2221.650.002 3**A2117.251117.25226.210.000 1**B291.32191.32176.180.000 1**C2112.851112.85217.720.000 1**残差3.6370.52失拟项0.2830.0940.110.948 1纯误差3.3540.84总误差606.6216注：1.R2=0.994 0，R2Adj=0.986 3，变异系数（CV）=1.13%。2.“*”表示差异显著（P0.05）；“**”表示差异极显著（P0.01）。2.2.1验证试验通过Design-Expert 8.0.6 Trial推荐菊糖蔗糖酶的酶活预测值为72.029 U/g。根据响应面优化结果，修正得出菊糖蔗糖酶固定化最佳条件为：SA浓度为2.8%、CaCl2浓度为3.8%、固定化时间3.0 h，进行3组平行试验，所得固定化菊糖蔗糖酶的酶活均值为78.82 U/g，说明响应面法优化菊糖蔗糖酶固定化条件可靠。2.3固定化酶的酶学性质2.3.1固定化酶与游离酶的热稳定性（见图6）由图6可知，当温度低于40 ℃时，菊糖蔗糖酶的游离酶和固定化酶活性相差不大，说明菊糖蔗糖酶适合储存在低温环境中，处理温度继续升高，游离酶和固定化酶的活性降低，但游离酶下降更显著，当温度为60 ℃时，游离酶的相对酶活31.17%，固定化酶保留最高酶活55.38%的酶活性，说明固定化具有更好的热稳定性。因为固定化载体与酶分子之间存在多种作用力，对酶分子的空间结果具有保护作用[36]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.F006图6固定化酶与游离酶的热稳定性2.3.2固定化酶与游离酶pH值稳定性（见图7）由图7可知，本试验来源的菊糖蔗糖酶在酸性环境中的稳定性较好。当在pH值小于5.0缓冲溶液中处理一段时间，游离酶和固定化酶的相对酶活相差不大；固定化酶菊糖蔗糖酶储存在pH值5.0的缓冲液中效果最佳，游离酶存储在pH值5.5的缓冲液中相对酶活最高；在缓冲溶液pH值6.0~8.0时，固定化酶和游离酶酶活均有不同程度的降低。固定化酶更稳定，原因可能是酶分子经过固定化后，通过各种作用力结合到载体上，导致酶蛋白分子的刚性增强，使酶分子对pH值的敏感度下降，稳定性更好[37]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.F007图7固定化酶与游离酶pH值稳定性2.3.3固定化菊糖蔗糖酶操作稳定性（见图8）由图8可知，随操作次数的增加，固定化菊糖蔗糖酶的相对酶活缓慢降低。原因是连续操作使凝胶颗粒强度下降，酶分子流失过多，导致酶活性降低[24]。固定化菊糖蔗糖酶在连续操作10次后，相对酶活力只损失38.85 %，说明固定化酶具有很好的操作稳定性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.016.F008图8固定化菊糖蔗糖酶操作稳定性3结论通过采用单因素试验和响应面试验得到菊糖蔗糖酶的固定化条件：海藻酸钠浓度为2.8%，氯化钙浓度为3.8%、固定化时间3.0 h，戊二醛浓度为0.035%，交联时30 min，经过固定化的菊糖蔗糖酶酶学性质得到大幅度提高。