现代畜牧业养殖中动物饲料以玉米豆粕型饲粮为主。目前,我国以豆粕为主的蛋白质饲料资源较为短缺[1]。羽毛是家禽工业的副产品[2-3],氨基酸组分比较齐全,除赖氨酸、蛋氨酸含量低于鱼粉外,其余氨基酸含量均高于鱼粉,且胱氨酸的含量居天然饲料之首,富含钾、钙、镁、铁等矿物质,是很好的非常规蛋白质饲料资源,羽毛中营养水平见表1[4]。家禽羽毛中含有80%以上的角蛋白,是一种机械强度高、化学性质稳定的硬质蛋白,很难被动物消化吸收[5-7]。经物理和化学降解法处理的羽毛废弃物,利用价值显著降低,会造成环境污染[8]。微生物发酵羽毛粉是使用酶制剂水解羽毛角蛋白,使其变为畜禽可吸收的羽毛蛋白。微生物降解羽毛废弃物在畜禽养殖的应用发现,通过在畜禽饲粮中添加酶解羽毛粉能够显著降低肠道蛋白酶活力,对动物生产性能没有明显影响,可显著降低饲养成本[9]。因此,在环境保护以及蛋白质资源短缺的情形下,研究利用微生物降解羽毛废弃物替代部分蛋白质饲料资源具有实际意义。文章就角蛋白酶水解羽毛废弃物的研究机理和羽毛废弃物在畜禽生产中的应用现状进行综述,为羽毛废弃物的应用提供参考。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.031.T001表1羽毛中营养水平营养水平含量粗蛋白质77.90水分12.00粗脂肪2.20粗纤维0.70粗灰分5.80钙0.20磷0.68%1羽毛废弃物的加工技术常用的水解羽毛废弃物的方法包括物理法、化学法和微生物发酵法。物理法是使用高温、高压水解法和膨化法破坏角蛋白的二硫键,将其转化为动物容易吸收的可溶性蛋白质。物理法的优点是技术成熟、生产成本较低;缺点是高温高压条件下需要处理时间久,氨基酸组分被严重破坏,饲料营养价值不高,且处理过程中会产生大量废气造成环境污染[10]。化学法是通过强酸强碱处理羽毛废弃物,破坏二硫键,打破空间结构,使其降解为氨基酸和肽等。市场上常用强碱如NaOH等碱性试剂对羽毛废弃物进行水解。化学法的优点是成本较低,缺点是氨基酸组分遭到强碱的破坏,产品品质降低,且中和过程中产生的盐类使得羽毛废弃物盐浓度偏高,当将处理后的羽毛废弃物作为饲料添加剂饲喂畜禽时会限制动物的生长[11]。微生物发酵法是利用细菌、真菌、放线菌等微生物产生的角蛋白酶对羽毛废弃物进行降解,将其转化成营养均衡的动物饲料或者生物肥料。微生物发酵法的优点是条件温和,能够有效避免热敏性氨基酸的损失,具有特殊香味,明显提高动物的适口性,对环境污染较小,不产生二次污染[12]。目前,利用微生物处理羽毛废弃物在饲料产业中具很广泛的应用前景。2微生物发酵羽毛废弃物2.1降解角蛋白的微生物资源羽毛废弃物在自然界中并不富集,且不易被自然环境降解[13],但自然界存在可以降解羽毛废弃物的微生物。目前已从微生物中筛选出能够分泌大量高效降解羽毛的降解酶微生物有真菌、放线菌和细菌在内的30多种微生物[14]。真菌是最早发现的能够降解羽毛角蛋白的微生物,如囊菌(Onygenaequina)、小孢子菌属(Microsporum)、毛癣菌属(Trichophyton)、赛多孢属(Scedosporium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和地丝菌属(Geotrichum)等真菌均具有降解羽毛角蛋白的能力[15-17]。蒋智等[18]在广西大明山、北海银滩和乐业天坑等地的土壤中分离出木霉属菌株。杨刚等[19]通过测定蛋白酶活力和与羽毛中可溶性蛋白含量评价米曲霉和枯草芽孢杆菌对羽毛的降解效果,结果表明,米曲霉的蛋白酶活力和产生可溶蛋白含量均优于枯草芽孢杆菌。但多数真菌是具有致病性的皮肤类真菌,存在于在人、动物的皮肤表面,实际应用中应避免使用。目前,也发现一些非致病性的真菌具有降解羽毛的能力,学者致力开发成产品应用于降解羽毛废弃物[20]。放线菌中存在能够降解角蛋白的菌株。Noval等[21]发现,弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)可利用羊毛产生角蛋白酶。目前,研究较多的能够降解角蛋白的放线菌是链霉菌属(Streptomyces)。马怡茗[22]在养鸡场堆积羽毛的土壤中分离得到一株微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus),结果发现,微白黄链霉菌具有很高的角蛋白酶活性,能够完整降解羽毛。周童娜等[23]在养鸡场长期堆积废弃羽毛处的土壤中筛出金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens),结果发现,金黄色节杆菌具有较强的分解羽毛角蛋白的能力,经过72 h发酵,对羽毛角蛋白的降解率可达75%。Gushterova等[24]从南极的土壤中分离筛选到1株可降解羊毛废弃物的南极放线菌(Antarctica ctinmycetes)。细菌中存在很多能够降解角蛋白的菌株,常用鉴定筛选菌株是采用16S rDNA测序的方法[25]。地衣芽孢杆菌PWD-1(Bacillus lincheniformis PWD-1)是该属中有效的羽毛降解菌,从中提取纯化得到的角蛋白酶已用于商业化生产[26]。研究发现,芽孢杆菌(Bacillus)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、气单胞菌(Aeromonas)等细菌均能够产生角蛋白降解酶[27];枯草芽孢杆菌S8既可以降解羽毛废弃物,还具有抗菌活性[28]。贾藏藏[29]在肉鸡养殖场病死鸡堆积点的土壤、屠宰场羽毛堆积点的土壤和鸡的肠道、肉鸡养殖场的粪便、堆肥样品等地点分离筛选出地衣芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。刘艳海[30]在环境中分离出地衣芽孢杆菌Y6(Bacillus licheniformis),菌株发酵降解羽毛72 h后能够完全降解羽枝。Haddar等[31]从虾废料中分离的地衣芽孢杆菌RP1对羽毛降解率可达75%,对羽毛粉降解率达90%。刘标等[32]筛选出的1株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)对猪毛角蛋白降解率为77.3%。2.2微生物降解羽毛的机理研究微生物降解羽毛的过程比较复杂,学者提出4种微生物降解羽毛角蛋白的机制,分别为膜电位理论、无机理论、物理压力理论和复合酶理论。复合酶理论是通过两种以上的酶共同作用角蛋白,打开角蛋白的二硫键,使其水解的过程。Yamamura等[33]从细胞外蛋白中纯化出蛋白酶和具有还原二硫键的功能的酶,将这两种酶单独使用,不具有还原二硫键的功能,而将两种酶混合后,水解角蛋白的活性增加50倍,表明两种酶在降解角蛋白过程中是协同增效,此过程具有协同作用。研究发现,打开二硫键是由于亚硫酸盐的水解作用,角蛋白水解过程涉及两个关键步骤——亚硫酸盐水解和蛋白质水解[34]。亚硫酸盐水解主要通过酶(如菌株分泌的硫化物还原剂如亚硫酸盐)打开角蛋白的二硫键,产生半胱氨酸残基硫醇,暴露更多的降解位点。蛋白质水解过程则是通过蛋白质水解酶打开连接β-折叠的氢键,将变性的角蛋白分解成多肽、寡肽和游离氨基酸。因此,降解角蛋白可以通过角蛋白水解酶和二硫键还原酶协同作用实现。细菌和真菌也表现出不同的降解机制[34],真菌降解角蛋白需先粉碎羽毛废弃物,经过亚硫酸盐水解和蛋白质水解,转化成动物可吸收的多肽氨基酸等。真菌降解角蛋白依赖半胱氨酸双加氧酶Cdo1,二硫键在亚硫酸盐的作用下分解成半胱氨酸,半胱氨酸双加氧酶Cdo1氧化半胱氨酸产生亚硫酸盐,如此循环降解角蛋白,与Meyers等[5]的结论一致。微生物降解角蛋白的作用机制已经取得一定进展,但还需要进行更多的研究确定角蛋白降解的关键酶。3微生物降解羽毛粉在畜禽养殖生产中的应用3.1微生物降解羽毛粉在家禽生产中的应用家禽饲粮中添加微生物水解的羽毛粉可以替代部分饲粮中豆粕和鱼粉,对畜禽生产性能和肠道消化性能影响不大。Adetunji等[35]使用地衣芽孢杆菌LMUB05角蛋白酶发酵羽毛粉替代饲粮中2.5%大豆饲喂肉鸡21 d,结果表明,发酵羽毛粉替代大豆不影响肉仔鸡的生产性能、血液指标和肠道组织结构。杨刚[36]在肉鸡饲粮中使用米曲霉和含蛋白酶基因重组酵母发酵羽毛粉替代鱼粉,结果发现,试验组肉鸡的生长性能、屠宰性能、肉品质和血液生化指标差异均不显著,且肠道蛋白酶活力显著升高,表明在肉鸡饲养前期和后期,分别使用发酵羽毛粉替代配方中5%和3%鱼粉是可行的。张旭等[37]研究表明,饲粮中添加复合酶制剂的羽毛粉饲喂临武鸭能够提高对骨粉和羽毛粉的常规养分、氨基酸和能量利用率。栗晓霞等[38]研究发现,在蛋鸡饲粮中添加2.5%比例的酶解羽毛粉代替饲粮中的豆粕可以明显改善经济效益,不影响蛋鸡采食量、产蛋量、料蛋比、产蛋率、平均蛋重差。3.2微生物降解羽毛粉在猪生产中的应用微生物降解羽毛粉替代鱼粉在猪生产中的应用较多,对生产性能和免疫指标影响不大。金妙仁等[39]研究表明,在饲粮中用酶解羽毛粉代替鱼粉对断奶仔猪日增质量、腹泻率和料重比均无显著影响。孙汝江等[40]使用酶解羽毛粉替换鱼粉饲喂断奶仔猪对仔猪的生产性能影响无显著影响,当酶解羽毛粉100%替换饲粮中鱼粉时,血清中总蛋白含量显著降低,由于酶解羽毛粉中残留的抗营养因子影响蛋白吸收。李晓燕等[41]在体外试验中采用胃蛋白酶和胰酶水解法消化两种羽毛粉(水解羽毛粉和酶解羽毛粉),测定蛋白质消化率;结果表明,酶解羽毛粉体外蛋白质消化率比水解羽毛粉提高15.38%。在动物试验中微生物降解羽毛粉可以替代3%鱼粉,且能够显著降低经济成本。3.3微生物降解羽毛粉在水产动物中的应用微生物降解羽毛粉作为蛋白源替代鱼粉在水产动物中应用较多。曹素会[42]研究发现,在饵料中添加酶解羽毛粉代替鱼粉饲喂大菱鲆幼鱼能够降低大菱鲆血脂水平及血液中总蛋白和白蛋白含量,显著降低肝脏转氨酶活性及肝脏抗氧化能力,在不影响营养物质的消化率和鱼体正常生长的前提下,大菱鲆饵料中可添加80 g/kg的酶解羽毛粉以替代部分鱼粉。Pfeuti等[43]在虹鳟饵料中添加酶解羽毛粉,结果发现,与投喂添加未经酶解处理的羽毛粉相比,试验组中的虹鳟生长率提高10.55%至11.55%。在罗非鱼饵料中添加8.8%的发酵羽毛粉或者5%的发酵羽毛粉不影响罗非鱼的生长[44-45]。因此,微生物降解羽毛粉作为蛋白源可替代部分鱼粉添加到饵料中,但若添加量过高会对水产动物的生长、饲料利用、体脂组成存在负面影响。3.4微生物降解羽毛粉在反刍动物中的应用关于羽毛粉在反刍动物生产中应用的研究较少。早期研究评价水解羽毛粉代替豆粕饲喂绵羊,结果表明,混合蛋白饲粮导致饲料效率降低,但对绵羊的采食量无不利影响[46]。Bae等[47]评价羽毛粉消化液对奶牛产奶量的影响,结果表明,添加量低于干物质摄入量的5%时不会影响奶牛的产奶量。在奶牛饲粮中加入水解羽毛粉,结果发现,羽毛粉的添加量在高于干物质摄入量的6.7%时,蛋白质可用性会降低,牛奶蛋白质浓度和产量线性下降[48]。将含有羽毛发酵成分的家禽垫料混合糖蜜饲喂绵羊,结果表明,绵羊纤维化酶的活性和固氮性都有所提高[49]。因此,虽然发酵羽毛粉在反刍动物上应用研究还较少,但在反刍动物中应用发酵羽毛粉具有一定的发展潜力。4展望合理利用家禽羽毛废弃物可缓解蛋白质饲料资源短缺,降低饲料成本,减少环境污染。今后应逐步深入研究,筛选和鉴定能够高效分解羽毛废弃物的菌种,其中抗菌活性可作为筛选过程中的参数。从自然环境分离得到的菌种的角蛋白酶活性均低,应通过构建角蛋白酶工程菌或菌株诱变提高酶活性。探索角蛋白酶发酵羽毛废弃物的最佳发酵条件,通过微生物发酵试验,确定发酵工艺参数,为大规模生产发酵羽毛粉提供参考。开发具有较高角蛋白降解活性的复合酶,发酵时可添加一些促进二硫键断裂的物质,提高角蛋白酶的催化效率。微生物发酵羽毛粉在饲粮中添加的具体的合适比例仍需进一步研究。

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