纤维性饲粮对动物的消化吸收和生产性能具有积极影响[1-2]。益生菌能够提高育肥猪的生长性能，改善肠道菌群多样性[3]。Wang等[4]在育肥猪日粮中添加适量苜蓿草粉，结果发现，盲肠微生物区系构成发生显著变化且丁酸产量大幅度增加。Zhang等[5]发现，适量添加苜蓿粉和纤维素可调节哺乳仔猪大肠中产丁酸菌的丰度和活性，使其转运至仔猪肠道黏膜，从而改善仔猪肠道健康。Luo等[6]应用测序数据和荧光定量PCR技术研究发现，仔猪日粮中添加豌豆纤维（PF）可改变结肠微生物群落。Zhao等[7]研究表明，饲粮中添加5%麦麸可显著增加猪粪便中乳酸杆菌与纤维菌数量。育肥猪肠道微生物结构在维持代谢稳态以及众多生理、神经和免疫功能中起着重要作用[8]，但育肥猪肠道内微生物数量庞大且易受多种因素影响。生长猪获取能量受日粮纤维种类的影响，育肥猪获取能量受日粮纤维影响较小[9]。育肥猪的肠道发育比仔猪更趋于完善，肠道微生物区系更稳定，能够更好获地利用日粮纤维[10]。猪利用日粮纤维很大程度上取决于纤维自身的可发酵程度。纤维木质化程度越高，可发酵性越低[11]。目前，关于育肥猪饲喂多种不同纤维来源混合饲粮的研究较多[12]，对单一纤维来源饲粮的研究较少。桂闽引象草、苜蓿、葛藤具有营养价值高、适口性好、产量高等特点，均具有较高含量不溶性纤维。目前，在育肥猪生产应用中主要关注的是不同纤维源对猪生长性能、胴体特征、肉质等方面的影响[13-14]，对肠道微生物菌群的研究较少。因此，本试验旨在探讨苜桂闽引象草、苜蓿、葛藤3种纤维源对育肥猪肠道微生物菌群的影响，探讨纤维类型与肠道微生物菌群的关系。1材料与方法1.1试验材料试验猪由广西壮族自治区畜牧研究所种猪场提供。将20头体重相近、健康的断奶猪随机分为4组，每组5个重复。各组纤维源性饲粮添加比例见表1。基础饲粮组成及营养水平见表2。第190日龄上午饲喂前，每组每头生长猪采取约100 g的新鲜回肠粪样，-80 ℃保存。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.T001表1各组纤维源性饲粮添加比例组别桂闽引象草组苜蓿组葛藤组对照组添加比例10450%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.T002表2基础饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100玉米64代谢能/(MJ/kg)14.31豆粕16粗蛋白/%15.26麦麸7粗脂肪/%4.37米糠9赖氨酸/%1.19预混料4钙/%0.86磷/%0.52注：1.预混料购自广西南宁加中生物科技有限公司。2.营养水平均为实测值。1.2肠道微生物测序提取粪便总DNA，选择16S rRNA基因V3~V4区作为扩增和测序的目的区间，扩增长度为468 bp，扩增引物序列：338F：5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3'，806R：5'-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3'，使用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统进行定量检测。将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，Hiseq2500 PE250上机测序。1.3测序序列处理MiSeq测序得到的双端序列数据，根据PE reads间的相互重叠关系，将成对的reads拼接成一条序列，将接头污染、复杂度低、质量低的reads去除，获得clean reads进行拼接，去除引物，根据序列首尾两端的条形码和引物序列区分样品，校正，得到有效序列。1.4生物信息学分析序列操作分类单元（OTU）注释和聚类分析在97%相似度下进行。通过RDP将OTUs的代表序列与silva数据库中的细菌序列进行比对，置信度阈值为0.6，分析样品菌落在门和属上的水平。将获取的OTUs与Genes数据库进行比对，把数据带入vegan评估样品覆盖率。利用QIIME软件绘制稀释曲线，对alpha多样性（ACE、Chao1、Shannon、Simpson）进行量化，各组间的alpha多样性由Tukey's进行测定，Kruskal-Wallis进行秩和检验检，对这些物种进行成对Wilcoxon秩和检验。在beta多样性分析中，使用QIIME软件生成加权和未加权的UniFrac距离矩阵。计算绘制R语言，统计主成分分析（PCA）和主坐标分析（PCoA），利用Vegan软件包制作NMDS分析图。基于16S rRNA数据，利用LEfSe进行组间丰度差异的可视化分析，评估不同组间物种丰度差异的显著性水平。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel统计整理，SPSS 20.0统计软件进行方差分析，Duncan's法多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1育肥猪肠道菌群多样性分析（见表3）由表3可知，测序共得到有效序列1 199 562条，平均序列长度447.43 bp。比对得到488个OTUs，覆盖率超过99.9%。试验组育肥猪肠道菌群丰度（OTUs、Ace和Chao1）均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.T003表3育肥猪肠道菌群多样性分析组别有效序列平均序列/bp覆盖率/%OTUsAceChao1ShannonSimpson桂闽引象草组285 893445.54±3.2999.94132.2±23.1a153.40±23.90a158.78±25.92a3.74±0.93a0.83±0.11苜蓿组271 013444.53±1.8599.95150.2±32.1a163.96±35.36a166.22±36.35a3.76±0.48a0.83±0.06葛藤组335 674452.32±5.7199.94128.0±43.1a150.63±29.55a151.53±31.65a3.43±1.18ab0.77±0.15对照组306 982447.46±3.2499.9577.6±24.9b97.4±22.22b95.81±21.67b2.88±0.22b0.79±0.04注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。测序数据质量评估见图1。图1测序数据质量评估10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.F1a1（a）OTU水平的Shannon稀释曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.F1a2（b）OTU水平的丰度稀释曲线由图1可知，OTU水平的Shannon指数及Sobs指数随测序数据量的增加趋于平坦。说明测序数据量已覆盖样本中的绝大多数物种。2.2育肥猪肠道微生物β多样性分析（见图2）由图2可知，在门水平分析加权PcoA和NMDS，猪回肠菌群不能完全区分，但可以看出聚为两类（桂闽引象草组与对照组，苜蓿组与葛藤组）。说明加权PcoA分析和NMDS结果是一致的，饲粮纤维源对猪肠道微生物菌群结构具有一定影响，且桂闽引象草组与对照组、苜蓿组与葛藤组的影响较为接近。图2育肥猪肠道微生物β多样性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.F2a1（a）加权PCoA分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.F2a2（b）NMDS分析2.3育肥猪肠道菌群结构及丰度差异（见图3、表4）由图3可知，桂闽引象草组检出8门106属，苜蓿组检出17门153属，葛藤组检出10门115属，对照组检出6门81属。菌门水平上，相对丰度大于1%的有厚壁菌门（Firmicutes）、变形杆菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria），3种菌门水平相对丰度在各组占比均高达98%以上。菌属水平上，各组间共有菌属88个，特有菌属35个（桂闽引象草组3个，苜蓿组30个，葛藤组2个）。图3育肥猪菌群组成分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.F3a1（a）门水平菌群相对丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.F3a2（b）属水平菌群相对丰度由表4可知，苜蓿组、葛藤组、桂闽引象草组Firmicutes的相对丰度均显著高于对照组（P0.05）。苜蓿组和葛藤组Clostridium sensu stricto1和Lactobacillus的相对丰度和高于桂闽引象草组、对照组（苜蓿组51.61%、葛藤组55.53%、桂闽引象草组24.39%、对照组28.80%）。桂闽引象草组的Romboutsia和Terrisporobacter的相对丰度和高于苜蓿组、葛藤组（桂闽引象草组36.42%、苜蓿组19.72%、葛藤组10.51%）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.T004表4肠道微生物菌群丰度差异菌群分类桂闽引象草组苜蓿组葛藤组对照组厚壁菌门（Firmicutes）80.05±2.98b87.42±2.83a86.33±3.06a73.56±2.14c变形杆菌门（Proteobacteria）6.75±0.93b5.51±0.55b6.02±0.96b25.54±1.45a放线菌门（Actinobacteriota）12.26±1.06a3.12±0.75c6.71±1.04b0.82±0.04d狭义梭状芽孢杆菌属（Clostridium sensu stricto1）16.99±1.19c45.41±2.23a16.72±0.76c25.90±1.01b乳酸杆菌属（Lactobacillus）7.40±1.08b6.20±0.82b38.81±1.30a2.90±0.72cRomboutsia25.19±1.58a5.16±0.45c4.62±0.69c18.24±1.47bTerrisporobacter11.23±0.28b14.56±0.13a5.89±0.32c11.68±1.81b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%2.4育肥猪肠道共有菌群和特有菌群分析（见图4）由图4可知，桂闽引象草组、苜蓿组、葛藤组、对照组共享145个OTU，占总OTU数的51.42%。从共享OTU中选取丰度前50的属进行层级聚类，表明桂闽引象草组和对照组表达模式相似，与加权PcoA分析和NMDS结果相一致。Lactobacillus、Clostridium sensu stricto1、Romboutsia、苏黎世杆菌属（Turicibacter）和Terrisporobacter这4种菌属在各组的丰度相对较高。特有菌群进行LEfSe分析说明桂闽引象草组的代表性细菌为：消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）、厌氧球菌属（Anaerococcus）、链球菌属（Globicatella）（LDA3.5）；苜蓿组的代表性细菌为：狭义梭状芽孢杆菌属（Clostridium sensu stricto1）、拟杆菌属（Bacteroidota）、莫拉克斯氏菌属（Moraxella）、梭菌属（Fusobacterium）（LDA3.5）；葛藤组的代表性细菌为：乳酸菌属（Lactobacillales）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、Negativicutes细菌群，韦荣氏球菌科（Veillonellaceae）、巨球形菌属（Megasphaera）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、柄杆菌目（Caulobacterales）、消化球菌科（Peptococcaceae）(LDA3.5)。图4育肥猪肠道共有菌群和特有菌群分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.F4a1（a）不同处理组OTU分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.F4a2（b）猪肠道菌群共有前50 OUT层级聚类分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.08.006.F4a3（c）猪肠道特有菌群LEfSe分析3讨论饲粮纤维是单胃动物消化道内源性酶不可消化的碳水化合物总称，包括非淀粉多糖（NSP）和木质素。NSP对育肥猪的肠道菌群的正向调控作用能够通过改善微生物群落结构以及改善益生菌和致病菌的比例等途径实现[15]。饲粮纤维的理化性质主要包括水合作用（水溶性、水结合力和吸水膨胀性）、黏性和可发酵性[11]。根据水溶性可将饲粮纤维分为可溶性纤维（SDF）和不可溶性纤维（IDF）。大部分可溶性纤维具有良好的可发酵性，不可溶性纤维的可发酵性则相对较差[16]。研究表明，仔猪日粮中添加3种不同纤维源（微晶纤维、菊粉、果胶）饲粮，回肠黏膜上定植的布鲁氏菌、葡萄球菌和红蝽菌等致病菌均显著降低，菊粉和果胶分别对后肠黏膜双歧杆菌和普雷沃式菌的定植具有显著促进作用[17]。Zhang等[18]研究表明，断奶仔猪日粮中添加适量苜蓿能够改善肠道菌群生物区系的构成。本课题组前期研究发现，添加不同浓度纤维源饲粮可提高育肥猪的生长性能，添加低浓度的葛藤可获得较好的效果[14]，可能是桂闽引象草、苜蓿、葛藤中不同纤维的组分差异及在肠道内的发酵程度不同导致的。猪体内缺乏消化纤维的内源消化酶，纤维必须在猪的肠道中被微生物发酵以获取能量[19]。肠道微生物的数量、菌群结构及平衡性与动物健康及消化功能密切相关[20]。本研究中，育肥猪肠道菌群丰度（OTUs、Ace和Chao1）均显著高于对照组，表明纤维类型能够显著影响猪回肠末端食糜微生物菌群的多样性，与张永婧等[21]报道一致；β多样性分析结果表明，猪回肠菌群不能完全区分，但可以看出聚为两类。原因是苜蓿和葛藤同属于豆科植物，所含中性洗涤纤维和半纤维素的量接近，桂闽引象草属于禾本科植物，与豆科植物含量相差较远，前两者具有相似肠道发酵模式。不同草种所含纤维素、半纤维素、木质素、β-葡聚糖的量、可溶性、木质化程度等差异也是导致β多样性存在差异的主要原因[15,22]。猪肠道（结肠、盲肠）主导菌群主要属于厚壁菌门和拟杆菌门，90%以上的细菌均属于这两种菌门[23-24]，回肠的微生物组成与以上结果有很大的差异。在回肠中厚壁菌门和变形杆菌门是两个优势菌门，变形杆菌门比例占5%~40%[25]，特定消化道位置存在特定的微生物菌群结构。本试验中，厚壁菌门、变形杆菌和放线菌门是育肥猪肠道微生物的主要菌门，与Isaacson等[25]报道基本一致。Evans等[26]研究表明，厚壁菌门含有大量分解纤维的细菌。本研究中，苜蓿组厚壁菌门相对丰度高于葛藤组、桂闽引象草组。原因可能是前者饲粮中酸性洗涤纤维含量高于后者有利于其定植[27]，表明饲粮中添加适量苜蓿可有效促进纤维素的分解。本研究还从属水平鉴定出狭义梭状芽孢杆菌属、乳酸杆菌属为苜蓿组和葛藤组的优势菌属，总平均丰度分别占回肠食糜微生物总量的53.6%，与Lamendella等[28]在猪肠道内的研究结果相似，表明饲粮中添加适量苜蓿和葛藤能够有效促进纤维素的分解。本试验中，桂闽引象草组的代表性细菌为：消化链球菌科、厌氧球菌属、链球菌属。前者在藏仔猪肠道微生物菌群结构在不同生长发育阶段存在差异，随着藏仔猪的生长，对营养物质的降解能力和肠道免疫能力提高[29]。苜蓿组的代表性细菌为：狭义梭状芽孢杆菌属、拟杆菌属、莫拉克斯氏菌属（Moraxella）；前者具有结构复杂的多功能纤维小体，能够降解不溶性的木葡聚糖和木聚糖等半纤维素，也能够有效降解纤维素，释放可溶性寡糖[30]。苜蓿组的可溶性非淀粉多糖含量较高，为这些菌属提供充足的代谢底物。葛藤组的代表性细菌为：乳酸菌属、芽孢杆菌纲、Negativicutes细菌群、韦荣氏球菌科、巨球形菌属、短波单胞菌属、柄杆菌目（Caulobacterales）、消化球菌科；前者的某些乳酸菌菌种能够分泌阿拉伯木聚糖水解酶，在木寡糖或阿拉伯木聚糖培养基内生长[31]。Ivarsson[32]报道，高含量不溶性纤维物可促进猪肠道内乳酸杆菌的生长，说明特有菌群的存在能够有效促进纤维素的溶解。4结论不同纤维源饲粮对育肥猪肠道菌群的生物构成有一定影响，部分菌群相对丰度和特有菌群数量的变化较明显，添加苜蓿和葛藤可明显改善肠道菌群组成和数量。