钙是饲料中主要的营养成分之一，也是检验饲料是否达标的一项重要指标。饲料中钙含量过低，动物会出现软骨症、骨质疏松和瘫痪等[1]，会影响鸡群的生长发育，导致鸡生长迟缓，骨骼发育不良[2]。钙含量过高则动物会出现厌食，或因钙盐沉积导致痛风等疾病。目前，测定钙含量的方法包括高锰酸钾试验法、乙二胺四乙酸二钠络合滴定法（EDTA法）、原子吸收火焰分光光度法、双氧水法、电导滴定法、均相沉淀法、离子色谱法等，各种方法均具有优点和缺点。高锰酸钾法是国标法，也是目前常用的检测方法。在《饲料中钙的测定》（GB/T 6436—2002）[3]和《饲料中钙的测定》（GB/T 6436—2018）[4]两版国标中，均涉及采用盐酸溶液和浓硝酸溶解灰分的环节，但未明确浓硝酸添加量。在实际试验中，需添加硝酸进行酸溶灰分。草酸钙沉淀环节需要以甲基红为指示剂、使用氨水和浓盐酸调节pH值，保证适宜草酸钙沉淀的酸性环境。但因浓硝酸具有强氧化性，不同的浓硝酸添加量可影响甲基红指示剂的变色情况，进而影响草酸钙沉淀环节的pH值，对试验结果准确性的影响尚未可知。因此，本试验研究高锰酸钾试验法中浓硝酸的不同添加量对钙含量的影响，以期为后续的生产实践提供参考。1材料与方法1.1测定原理高锰酸钾法的基本原理是将试样有机物破坏，钙物质变成溶于水的钙离子，并与盐酸反应生成氯化钙。在溶液中加入草酸铵溶液，使钙成为草酸钙白色沉淀，采用硫酸溶液溶解草酸钙，以高锰酸钾标准溶液对草酸钙沉淀进行滴定检测。根据高锰酸钾标准滴定溶液的用量，计算试样中钙的含量。1.2饲料样品为保证试验的代表性和准确性，选择钙含量高、中、低等3种典型饲料样品，即鱼粉、羊精料、棉粕。样品采集按照《饲料分析及饲料质量检测技术》[5]的方法进行。1.3试验仪器FW177样品粉碎机、40目分析筛、CP224C分析天平（感量0.000 1 g）、称量纸、FP-14马福炉（550±20）℃、瓷质坩埚；100、200 mL容量瓶；50 mL酸式滴定管、玻璃漏斗（直径6 cm）、中速定量滤纸；10、20 mL移液管；300 mL烧杯等。1.4试验设计试验采用3×4设计，选择3种典型饲料（钙含量高、中、低）作为试验样品，每一样品设计4种（分别为3、6、9、12滴）硝酸添加量溶解灰分，每组重复3次，记录氨水、盐酸的使用量，测定钙含量。由于不同实验室所使用的药剂滴管粗细不同，为使测定结果具有更好的借鉴意义，统一将滴管使用滴数转化为mL数，经测定本次试验所用试剂滴数与mL的转化关系为：1滴盐酸等于0.05 mL盐酸量，1滴氨水等于0.05 mL氨水量，1滴浓硝酸等于0.025 mL浓硝酸量。1.5试样分解液制备称取待测试样2~5 g（准确至0.000 2 g）置于坩埚中，电炉上碳化至无烟，将其转入550 ℃高温炉中灼烧3 h以上，至灼烧完全。在坩埚中加入10 mL的1∶3盐酸溶液和数滴浓硝酸（根据试验设计，浓硝酸添加量分别为3、6、9、12滴），煮沸约10 min。将该溶液无损失地过滤至100 mL或200 mL容量瓶，采用蒸馏水彻底洗涤坩埚及滤纸，滤液冷却至室温，定容、摇匀，此为试样分解液。1.6试样的测定试样的测定完全按照GB/T 6436—2018饲料中钙的测定方法进行，包括草酸钙沉淀、沉淀洗涤以及沉淀溶解与滴定。1.7数据统计与分析试验数据采用Excel 2019软件进行整理，SAS 9.2软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA)。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同浓硝酸添加量对鱼粉中钙含量测定结果的影响（见表1）由表1可知，在草酸钙沉淀环节中为调节pH值所使用的氨水，盐酸以及初次调节pH值煮沸后补加的盐酸量在各硝酸处理组间的差异均不显著（P0.05），且不同硝酸处理对鱼粉最终钙的测定结果差异也不显著（P0.05）。研究表明，灰分溶解中不同浓硝酸的添加量对鱼粉钙含量测定的结果无显著影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.025.T001表1不同浓硝酸添加量对鱼粉中钙含量测定结果的影响项目组别SEMP值3滴6滴9滴12滴1∶1氨水/mL0.350.340.350.390.020.351∶3盐酸/mL0.090.100.100.130.020.62草酸铵后补加盐酸/mL0.210.200.130.180.040.43钙/%3.563.673.633.340.110.172.2不同浓硝酸添加量对羊精料中钙含量测定结果的影响（见表2）由表2可知，在草酸钙沉淀环节中为调节pH值所使用的氨水、盐酸以及初次调节pH值煮沸后补加的盐酸量在各硝酸处理组间的差异均不显著（P0.05），且不同硝酸处理对羊精料最终钙的测定结果差异也不显著（P0.05）。研究表明，灰分溶解中不同浓硝酸的添加量对羊精料钙含量测定的结果无影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.025.T002表2不同浓硝酸添加量对羊精料中钙含量测定结果的影响项目组别SEMP值3滴6滴9滴12滴1∶1氨水/mL0.330.330.350.350.030.221∶3盐酸/mL0.080.080.080.050.030.80草酸铵后补加盐酸/mL0.150.150.150.15——钙/%0.490.500.420.470.020.192.3不同浓硝酸添加量对棉粕中钙含量测定结果的影响（见表3）由表3可知，在草酸钙沉淀环节中为调节pH值所使用的氨水、盐酸以及初次调节pH值煮沸后补加的盐酸量在各硝酸处理组间的差异均不显著（P0.05），且不同硝酸处理对最终钙的测定结果差异也不显著（P0.05）。研究表明，灰分溶解中不同浓硝酸的添加量对棉粕钙含量测定的结果无影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.12.025.T003表3不同浓硝酸添加量对棉粕中钙含量测定结果的影响项目组别SEMP值3滴6滴9滴12滴1∶1氨水/mL0.560.560.560.610.030.311∶3盐酸/mL0.200.090.110.080.060.17草酸铵后补加盐酸/mL0.180.110.200.140.060.42钙/%0.620.630.630.600.040.803讨论高锰酸钾法适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混料和单一饲料中钙的测定。目前，将高锰酸钾法作为钙含量测定的国家标准方法，在使用其他方法有争议的情况下需要用高锰酸钾法进行仲裁检验。朱宇旌等[6]和汪迎春[7]通过试验对比发现，高锰酸钾法在准确度和精确度上均高于其他方法。因此，高锰酸钾法常应用于实践、教学过程中测定饲料中钙的含量。试验分解液制备是高锰酸钾法检测钙磷指标重要的环节。分解液制备就是灰分溶解环节，即使用1∶3盐酸和浓硝酸进行溶解再定容到容量瓶中，灰分溶解不充分，结果不会准确.该环节中浓硝酸的添加是为增强溶解液的氧化性和酸性，保证灰分的充分溶解。但在高锰酸钾国标检测方法中未对浓硝酸量进行定量，若在实际应用中随意添加浓硝酸，将导致后续pH值调节过程（颜色调节控制）出现各种情况。草酸钙沉淀过程将试样分解液使用1∶1氨水和1∶3盐酸进行pH值调节，加入草酸铵溶液煮沸加入1∶3盐酸，放置过夜使沉淀充分陈化。灰分溶解过程是否对后续试验结果存在影响、草酸钙沉淀不完全的情况是否与此相关、检测结果变异大是否与此相关等问题均尚不明确。因此，研究设计了本试验，以期为后续试验应用研究提供参考。通过本试验鱼粉、羊精料、棉粕等3种典型饲料样品的检测结果可知，不同添加量的浓硝酸处理的饲料样品，尽管使用过程中调节溶液酸碱度的试剂量不一致，但最终钙的测定结果均未呈现显著差异，提示高锰酸钾试验法测定饲料中钙含量时，选择使用少量的浓硝酸即可解决问题。4结论利用高锰酸钾试验法测定饲料中钙含量，浓硝酸的不同添加量对pH值调节过程中试剂使用量及最终钙含量的测定结果无显著影响。生产中选择用少量的浓硝酸即可溶好灰分，降低成本。