与应用（项目编号：222102110446）”呕吐毒素（vomitoxin）是从赤霉病污染的大麦植株中发现[1]。Krska等[2]研究表明，呕吐毒素的分子结构为雪腐镰刀菌烯醇的4-脱氧衍生物，定名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（4-deoxynivalenol，DON），由于其可导致猪出现严重的呕吐症状，命名为呕吐毒素。DON的产毒菌株适合在阴暗、潮湿的环境条件下繁殖，普遍存在于大麦、小麦、玉米和燕麦等粮食作物及制品中。因此，寻找高效地检测饲料中呕吐毒素的方法，利于保障食品安全。文章对DON检测技术和方法的研究进行总结和分析，以期为饲料原料和饲料中呕吐毒素的检测研究提供参考。1呕吐毒素的危害近年来，玉米及其副产物和小麦及其副产物DON的检出率达100%，饲料中DON检出率较高，粕类饲料原料中DON检出率相对较少[3-6]。DON通过影响DNA和RNA的合成以及阻断翻译启动过程而影响蛋白质组成[7-8]。DON对动物健康的影响大多集中在消化系统、肾脏，可引起消化道弥散性坏死、严重皮炎、免疫力下降、生殖器官疾病。猪是对DON敏感程度最高的动物，其次是家禽[9]。呕吐毒素的外在毒性反应包含急性毒性、细胞毒性、免疫毒性、肠道毒性等。DON的急性毒性主要与动物的种类、年龄、性别和暴露途径相关，雄性动物对于毒素的敏感特异性更高。急性中毒的动物主要症状为站立不稳、反应迟缓、立毛、食欲不振、呕吐等。生长育肥猪饲喂含有14 mg/kg DON的饲料10~20 min就会出现呕吐、焦躁现象。Trenholm等[10]研究发现，当DON含量在0~14 mg/kg，每增加1 mg/kg DON，猪的采食量降低6%，浓度达到10 mg/kg以上，出现拒食现象。DON具备的细胞毒性含量较高。针对胃肠黏膜细胞、淋巴细胞、胸腺细胞以及生长繁殖迅速的细胞均具有损伤影响。Perincherry等[11]研究表明，DON针对谷类细胞产生明显的毒性反应，会破坏植物细胞壁，促使产生钠离子和钾离子。Rizzo等[12]研究表明，DON对大鼠的红细胞具有溶血影响。Liao等[13]根据DON的免疫毒性的研究，不同剂量的DON可能在促进或抑制的情况下引起免疫应答的变化，且DON和免疫应答之间存在剂量关系。DON既是免疫抑制剂又是免疫刺激剂，效果与剂量、时间直接相关。DON浓度过高导致免疫反应受到影响，浓度过低导致各种慢性炎症疾病的发展。Greene等[14]以大鼠为研究对象，对其肾病情况展开12 w的动物试验，DON含量为0、2、10、25 mg/kg，试验组大鼠血浆内的IgA含量呈现明显上升趋势，雄性动物上升含量更高。Lee等[15]研究表明，高浓度DON会使淋巴细胞生长和免疫球蛋白的形成受到影响，在低浓度的环境中免疫球蛋白数量具有明显的上升趋势。通过在腹腔内注入DON后12 h，可以观察到小鼠胸腺内凋亡的细胞数量呈现不断上升趋势，生长受到明显的抑制，伴随着DON含量的不断提升这种效果越来越显著。DON被摄食后在消化道内吸收，DON主要破坏肠道的屏障功能和微生态环境。体外和体内研究表明，DON抑制肠道营养吸收[16]，改变肠道细胞功能[17]，损害肠道屏障功能[18]。肠道屏障主要是由封闭细胞间空间的紧密连接形成。DON可以通过紧密结合，渗透肠黏膜。DON可以打开紧密连接，提高肠细胞的通透性[19]。猪食用DON污染的饲料会导致胃和肠道上皮损伤，引起肠道炎症反应[20]。Awad等[21]研究发现，饲喂DON污染的饲料（1和5 mg/kg）5 w后，肉鸡小肠绒毛长度和吸收表面积降低。Waché等[22]研究表明，DON会改变动物的肠道菌群的数量、组成及分布。除上述毒性作用外，DON毒性效应还具有神经毒性、遗传毒性、生殖毒性，且DON常和其他霉菌毒素并存，产生协同效应，导致中毒的动物病症加重。2呕吐毒素的检测方法目前，检测DON主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附测定法、胶体金测试法、气相色谱法及气相色谱-质谱联用、高效液相色谱法、化学发光免疫分析法、膜基质免疫分析法、荧光免疫分析法和傅里叶转换红外光谱法等。2.1薄层色谱法（TLC）按照GB/T 8381.6—2005和GB/T 5009.111—2003[23-24]，薄层色谱法测定DON的基本原理是对试样中的DON提取，净化，浓缩和硅胶G薄层板展开后针对其进行加热，从而使DON能够在紫外灯的照射下呈现出蓝色的荧光，按照其在薄层板上呈现荧光的最低检出量计算含量。RochaD等[25]研究用于DON的TLC定量程序的提取方法，验证TLC方法对DON评价可靠性，其检测限和定量限分别为TLC板上的30和100 μg/L。Cecilia等[26]采用乙腈-水提取，经碳-氧化铝-锡石柱净化后，使用乙腈代替乙酸乙酯转移含有DON的浓缩提取液。在200、400和800 ng/g的小麦重复试验中添加DON的平均回收率分别为83%、82%和72%，检出限为40 ng/g。2.2酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA技术方法具体运用的原理是将酶分子和抗体分子组合在一起，特异性的组合对于抗体免疫学无太大的影响，同时有效保障蛋白质分子具备的生物学活性[27]。当滴入某种溶液试剂后，在酶的催化下，底物能够从无色还原转化为有色氧化，引起呈色反应，性状会发生特异性的改变。因此，对应的免疫应答的有无可以由基质的呈色反应来决定，呈色反应的深度与样本中对应的抗体或抗原的量成正比。这种呈色反应可利用结合酶化学反应的高灵敏度以及对抗原抗体反应的高特异性的ELISA检测器加以量化测定，ELISA法是一种特异性、灵敏度高的检测方法。Han等[28]开发一种自组装直接竞争酶联免疫吸附试验（dcELISA）试剂盒，用于检测食品和饲料谷物中的DON，试剂盒对DON的最低检测限为0.62 ng/mL，线性范围为1.0~113.24 μg/L。韩丽等[29]为测定动物饲料中的DON而构建抗DON mAb，自主研发DON的icELISA检验试剂盒；试剂盒对DON的极限测试含量为1.147 μg/L，测试区域为1.50~130.31 μg/L，对DON检测具备准确、可靠、方便、快速、高通量等特点。李华等[30]以DON为对象，使用半琥珀酰化DON牛血清蛋白耦联物（3-HS-DON-BSA）当作免疫原，采用多点注射法免疫Balb/c小鼠和豚鼠，取得DON牛的多抗体血清，构建间接ELISA检测方法，该方法检测成本低、方便，可广泛用于谷物及其成品DON毒素含量的检测。2.3胶体金免疫层析法（GICA）GICA主要在膜上固化特定的抗原和抗体，结合垫上吸附胶体金标记试剂。在样品垫中加入样品，通过毛细管作用前进，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动到某种固定的抗原或抗体区域内时一旦待检物和胶体金标试剂结合物发生特异性的反应以后就会聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果[31]。这种方式在临床中运用极为方便快捷且特异性较高。栾振祥[32]将小麦作为研究对象，采用免疫亲和高效液相色谱分析小麦中DON，与胶体金试纸法进行比较，得到的准确度范围在85.4%~128.2%。在实验室样品检测中，使用胶体金检测试纸法进行检测，对超过标准的使用高效液相色谱法确定，可以大大提高实验室检测效率。Huang等[33]建立一种竞争格式的胶体金免疫层析条带（ICS）技术，用于小麦和玉米样品中DON和ZEN的快速检测，DON和ZEN的检测线为1 000 μg/kg和60 μg/kg，该方法无须专用仪器，是一种快速、经济的筛选技术。2.4气相色谱法及气相色谱-质谱联用（GC/GC-MS）气相色谱法主要备的特性是以气体作为流动相，固定相和流动相中物质分配系数截然不同，使种类不同的化合物从色谱柱内流出的时间存在显著差异性，具体运用时能够实现不同化合物的有效分离。质谱法主要特点是根据带电粒子的情况，针对质量和强度进行测定，在具体运用过程中可以明确得到化合物分子状况和具备的元素组成情况。气相色谱-质谱联用法兼备色谱的高分离能力和质谱的强定性能力。在操作时更加方便快捷。Haikka等[34]采用GC法在挪威进行田间试验，春燕麦、冬小麦、春小麦和春大麦中DON平均含量分别为0.32、0.22、1.48和0.54 mg/g，不同品种间DON含量差异不大。Yue等[35]利用电子捕获气相色谱法测定中药材及相关产品中DON含量，采用GC-MS进一步证实阳性结果，最低检出限为2.0 μg/kg。2.5高液相色谱法（HPLC）高效液相色谱是使用液体作为流动相，通过高压注入系统，在固定相的色谱柱中加载具有不同极性特性的单一或混合溶剂，在柱内各成分被分离后，采用精密的仪器针对各元素成分进行检测[36]。根据GB 5009.111—2016[37]免疫亲和层析净化高效液相色谱法，对试样液内DON用水提取，通过运用高效液相色谱-紫外检测仪器针对各种成分元素进行定量的检测分析。HPLC具有高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广泛等特点。但HPLC检测时间长、仪器昂贵，难以在基层普及检测。Li等[38]采用新型DON单克隆抗体制备免疫亲和柱（IAC），并用作谷物中DON超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）分析前的净化工具，DON的回收率较高。Gonalves等[39]开发一种测定谷物中DON及其主要结合物的方法，与高效液相色谱、柱后衍生化和荧光检测相结合的免疫亲和柱IAC净化，检出限为3 μg/kg，回收率为98.5%。Lee等[40]研究一种同时测定B型单端孢霉毒素、DON和NIV及其DON3G和NIV3G的简单可靠的方法，该方法检出限为4.4 μg/kg。2.6化学发光免疫分析法（CLIA）化学发光免疫分析方法是Halmann等[41]根据免疫学反应基础原理，结合现代化学发光分析技术，建立的一种新的免疫分析方法。化学发光免疫分析在具体实践中采用的方式是通过化学检测试剂来实现光信号通路的传递，利用光检测仪器测定发光强度时，被测定物与光强度之间在特定条件下存在关联，以此来达到检测目的[42]。CLIA与其他技术相比，除具有化学发光技术的高灵敏性与免疫反应的高特异性的特点，还具有检测范围广泛、仪器操作简便、无放射性污染等优势[43]。Nolan等[44]将样品研磨并用乙腈-水萃取，部分提取物通过MycoSep No. 225柱进行净化，蒸发至干，使用硝酸氧锆和乙二胺的甲醇溶液衍生，生成的DON荧光衍生物用含有宽波长脉冲氙光源的校准荧光计进行鉴定和定量；该方法对0.5至50 mg/kg的DON浓度进行定量，在未受污染的小麦样品中添加0.5、5、10、25和50 μg/g DON时呈线性。王毅谦等[45]根据抗原和抗体的特异性反应，选用磁性颗粒作为固相载体，利用优化磁性颗粒稀释和反应时间等工作条件，建立高精度高重复性的DON-CLIA。陈永忠等[46]采用鲁米诺-双氧水-辣根过氧化物酶-对羟基联苯体系，建立增强化学发光酶联免疫分析定量检测DON水平的方法。2.7其他方法Girolamo等[47]利用傅里叶变换-近红外光谱（FT-NIR）建立硬粒小麦样品中DON含量的定量分类模型。Maragos等[48]开发用于DON的单克隆抗体的荧光偏振（FP）免疫测定，该测定基于来自具有荧光标记的DON、DON-荧光素（DON-FL）的样品中未标记的DON对溶液中DON特异性单克隆抗体的竞争。Cl等[49]研究一种用于多重检测霉菌毒素的多波长荧光偏振免疫测定法（MWFPIA）。DON、T-2毒素和伏马菌素B-1（FB1）使用不同的染料标记，MWFPIA使用示踪剂和特异性单克隆抗体（mAb）同时检测，DON的检测限为242.0 μg/kg。康敏等[50]为同时检测玉米中的FB1和DON，建立基于聚偏氟乙烯膜（PVDF）基质的直接竞争免疫分析法。FB1和DON的检测极限分别是2.5和50 μg/L。3展望随着大型精密仪器检测技术和分子生物学技术的迅速发展，对DON的检测研究越来越详细。DON的毒性作用将得到更多的阐述，其检测技术也将会更加完善。