异养小球藻包括动物所需的必需氨基酸、小球藻生长因子、叶黄素、藻蛋白和藻油等营养物质。异养小球藻氨基酸种类齐全，且配比接近标准模式，基本能够满足人和动物的生长需要，是一种优质的单细胞蛋白源[1-3]。目前，部分蛋白含量超过50%的小球藻粉已制成小球藻片、鱼苗饵料等产品推向市场[4-6]。目前，藻类蛋白大多作为添加剂直接与鱼粉、豆粕等原料直接混合饲喂动物[7-9]，饲喂方法简单快捷，综合成本较低。利用小球藻进行沼气发酵、制备有机肥均处于研究开发阶段[10]，由于小球藻的生产成本限制了其进一步的应用。我国蛋白饲料原料主要是大豆，但大豆的产量较少。而异养小球藻的培养可利用工业发酵装置，占地面积小、生长速度快、不受气候季节影响，能够获得大批原料，满足饲料生产需要。小球藻含有丰富的氨基酸和矿物质，能够减少饲料添加剂的使用。小球藻直接饲喂生猪，猪增重至少提高了2.7%[11-12]。混合菌发酵饲料能够大大改善饲料的适口性、易被消化，能够提高饲料的营养价值[13-15]。因此，小球藻发酵饲料规模化应用能够缓解饲料行业蛋白原料不足的问题，产生明显的经济效益和社会效益。本试验旨在研究一种异养小球藻发酵饲料及其制备方法，并将异养小球藻发酵饲料在仔猪养殖中应用，为异养小球藻发酵饲料在仔猪养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用异养小球藻由河南天冠集团车用生物燃料技术国家重点实验室提供，为异养小球藻粉、异养小球藻细胞破碎液和异养小球藻提油后的藻渣。麸皮和豆粕购自南阳市饲料公司。黑曲霉（保藏编号：CICC 2041）、乳酸菌（保藏编号：CICC 21791）、酵母菌（保藏编号：CICC 31994）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。1.2试验方法1.2.1异养小球藻发酵饲料的制备方法异养小球藻发酵饲料，由异养小球藻复合培养基经固态发酵制得。将5 kg异养小球藻粉加入1 kg质量比为1∶1的麸皮和豆粕混合物中，混匀，得到异养小球藻复合培养基。将黑曲霉菌、乳酸菌和酵母菌以5∶3∶2的质量比混合后得到复合菌，按照50 g/L的质量体积浓度接种到异养小球藻复合培养基，调节含水量为20%，在温度37 ℃、湿度87%的条件下固态发酵3 d，即得异养小球藻发酵饲料。1.2.2仔猪饲喂试验试验在南阳市宛城区红泥湾猪场进行，选择猪场断奶“杜×长×大”三元仔猪保育舍单元2栏，共40头，随机分为2组（试验组和对照组），每组5重复，每个重复4头，由专人采用相同的饲养方法。试验期15 d。试验组采用该猪场仔猪料基础日粮+5%异养小球藻发酵饲料；对照组饲喂猪场仔猪料基础日粮，每天记录每组仔猪的给料量和饲料浪费量。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.008.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100玉米63消化能/(MJ/kg)13.66豆粕26粗蛋白/%17.32麸皮5钙/%0.54鱼粉2赖氨酸/%0.93预混料4蛋氨酸/%0.30注：1.预混料购自南阳希望饲料有限责任公司。2.营养水平为计算值。1.3测定指标及方法1.3.1饲料营养成分粗蛋白含量参照GB/T 6432—2018测定；蛋白质溶解度参照DB13/T 812—2006测定；pH值使用pH计测定；总酸含量参照GB/T 12456—2008测定（酸的换算系数按乳酸0.09计）；粗纤维含量参照GB/T 6434—2006饲料中粗纤维的含量测定；粗灰分参照GB/T 6438—2007测定。活菌数采用平板菌落计数法，准确称取烘干的发酵物1 g于9 mL无菌水，系列稀释，在适宜各菌株生长的固体培养基上涂布平板计数；霉菌总数参照GB/T 13092—2006测定；大肠菌群参照GB 4789.3—2016测定。1.3.2生长性能试验开始前和结束后仔猪空腹12 h，每头仔猪编号，称重，分别统计每组仔猪的初重、末重，计算仔猪增重、平均日增重、平均日采食量、料重比。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=总采食量/(试验天数×仔猪头数)(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.3.3腹泻率试验期每天定时观察仔猪的排粪情况，记录每组仔猪每天腹泻头数。试验结束后计算每组仔猪的腹泻率。腹泻率=腹泻总头数/(试验天数×仔猪头数)×100%(4)1.3.4粪便菌群试验第15 d早晨，每组采集5头猪的新鲜粪便，放入标记好并提前高压灭菌的塑料瓶，采用冷冻冰包裹好放入泡沫箱，送回实验室进行大肠菌群和乳酸菌的测定。乳酸菌数量参照GB 4789.35—2016测定。1.3.5血清生化和免疫指标试验结束后，每组中随机选取5头空腹仔猪，使用一次性注射器采集前腔颈静脉6 mL，注入已编号的EP管中，采用冷冻冰包裹好放入泡沫箱中，送回实验室，3 500 r/min离心10 min，移出血清，-20 ℃保存。血清生化和免疫指标采用全自动生化分析仪（日立3100）进行检测，试剂盒购自武汉生之源生物科技有限公司。严格按照试剂盒操作说明测定总蛋白、白蛋白含量，谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶活性以及甘油三酯、葡萄糖、尿素、免疫球蛋白G（IgG)、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）含量，计算球蛋白数量和白蛋白/球蛋白值。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel整理，SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1异养小球藻发酵饲料营养成分及相关指标（见表2）由表2可知，与发酵前相比，试验制得的异养小球藻发酵饲料能够提高粗蛋白含量、蛋白质溶解度、总酸和粗灰分含量，降低pH值、粗纤维含量、霉菌总数和大肠菌群数量。结果表明，异养小球藻复合培养基经过固态发酵，纤维素含量下降，蛋白含量上升，发酵饲料中含多种消化酶、有机酸、维生素和天然抗菌物质，饲喂时可以减少饲料添加剂的使用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.008.T002表2异养小球藻发酵饲料营养成分及相关指标项目发酵前发酵后变化率/%粗蛋白/%46.82±0.2955.21±0.2417.92蛋白质溶解度/%72.58±2.4778.86±2.308.65pH值6.5±0.373.79±0.12-41.69总酸/%2.36±0.249.15±0.33287.71粗纤维/%6.11±0.354.98±0.23-18.49粗灰分/%5.86±0.266.12±0.224.44活菌数/(CFU/mL)—5.2×109—霉菌总数/(CFU/g)5.2×1047.1×103-86.35大肠菌群/(CFU/g)1.1×1043.0×103-72.73注：“—”表示未检测到该项目的含量。2.2异养小球藻发酵饲料对仔猪饲喂的效果分析2.2.1异养小球藻发酵饲料对仔猪生长性能的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，饲喂异养小球藻发酵饲料能够显著提高仔猪的平均日增重，降低料重比，表明试验制得的异养小球藻发酵饲料具有较好的经济效益。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.008.T003表3异养小球藻发酵饲料对仔猪生长性能的影响组别初重/kg末重/kg增重/kg平均日增重/[kg/(头·d)]采食量/(kg/头)平均日采食量/[kg/(头·d)]料重比试验组10.25±0.3515.56±0.67a5.31±0.64a0.354±0.04a8.540.5691.61b对照组10.36±0.3714.42±0.76b4.06±0.78b0.271±0.05b8.320.5552.05a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2.2异养小球藻发酵饲料对仔猪粪便菌群和腹泻率的影响（见表4）由表4可知，试验组仔猪大肠杆菌数量比对照组显著降低30.90%（P0.05），试验组乳酸杆菌数比对照组显著提高58.70%（P0.05）。仔猪腹泻多出现在试验前3 d，试验组比对照组腹泻率显著减少84.20%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.008.T004表4异养小球藻发酵饲料对仔猪粪便菌群和腹泻率的影响组别大肠杆菌/(CFU/g)乳酸杆菌/(CFU/g)腹泻率/%试验组5.12×1011b9.76×1011a1.00b对照组7.41×1011a6.15×1011b6.33a2.2.3异养小球藻发酵饲料对仔猪血清生化指标和免疫功能的影响（见表5、表6）由表5可知，试验组仔猪血清总蛋白、白蛋白、球蛋白的含量以及谷草转氨酶、碱性磷酸酶的活性均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.008.T005表5异养小球藻发酵饲料对仔猪血清生化指标的影响组别总蛋白/(g/L)白蛋白/(g/L)球蛋白/(g/L)白蛋白/球蛋白尿素氮/(mmol/L)葡萄糖/(mmol/L)碱性磷酸酶/(U/L)谷丙转氨酶/(U/L)谷草转氨酶/(U/L)甘油三酯/(mmol/L)试验组53.13±4.71a30.28±1.26a22.85±2.33a1.33±0.152.57±0.496.60±1.25219.36±15.62a35.47±2.1757.93±5.13a0.38±0.04对照组45.4.±5.32b25.45±3.73b19.95±3.25b1.28±0.172.83±0.566.20±1.03189.76±21.52b35.39±3.1243.97±3.45b0.27±0.03由表6可知，试验组仔猪血清中IgA、IgG和IgM水平均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.008.T006表6异养小球藻发酵饲料对仔猪血清免疫指标的影响组别IgAIgGIgM试验组1.36±0.09a10.13±0.34a1.26±0.11a对照组1.06±0.11b8.86±0.65b1.08±0.13bg/L3讨论3.1异养小球藻发酵饲料对仔猪生长性能的影响仔猪断奶后的一周内经常发生腹泻，是生猪养殖中无法避免的问题，主要是由于饲粮变更和大肠杆菌感染引起，导致仔猪肠道分泌功能和微生物菌群紊乱。发酵饲料中的益生菌能够抑制肠道内有害菌生长，提高对病原微生物入侵的抵抗能力，建立仔猪肠道内微生物区系平衡[16]；乳酸杆菌数量的升高，能够显著促进仔猪的消化、吸收功能，从而增强仔猪体质[17]。异养小球藻含有丰富且均衡的营养成分，如蛋白质、脂质、多糖、膳食纤维、矿物质、叶酸、叶绿素及维生素（A、B、C、D、E）等，还含有小球藻促进生长因子（CGF），可诱发干扰素，激发免疫组织中的巨噬细胞，促进有害物质的排泄。小球藻粉经过均质破碎处理，营养更易于吸收利用，经过发酵后更突出发酵饲料的特点，促进营养成分的吸收利用，异养小球藻复合培养基中加入少量麸皮和豆粕以快速达到饲料发酵的要求。本试验中，给仔猪饲喂添加5%的异养小球藻发酵饲料，能够提高肠道内乳酸杆菌的数量，明显减少大肠杆菌数量，大幅降低仔猪的腹泻发生率，显著提高仔猪的平均日采食量、平均日增重，降低料重比。3.2异养小球藻发酵饲料对仔猪血清生化及免疫指标的影响仔猪血清生化指标和免疫指标能够综合反映仔猪健康状况。血清总蛋白包括白蛋白和球蛋白，与蛋白质代谢和免疫功能密切相关；碱性磷酸酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶能够反映动物机体营养物质代谢能力；葡萄糖和尿素水平是评估机体营养状况的重要指标[18-19]。本研究显示，添加5%异养小球藻发酵饲料的仔猪，血清总蛋白、白蛋白、球蛋白的含量以及谷草转氨酶和碱性磷酸酶的活性均显著高于对照组，IgA、IgG和IgM水平比对照组显著提高，说明异养小球藻发酵饲料能够增强仔猪机体免疫功能，提高营养代谢水平，促进生长性能的提高。3.3异养小球藻发酵饲料的技术优势小球藻粉经过固态发酵，纤维素含量下降，蛋白含量上升，发酵结束后发酵饲料中含有多种消化酶、有机酸、维生素和天然抗菌物质，能够减少饲料添加剂的使用，符合目前绿色饲料、安全饲料的发展要求；经固态发酵，随纤维素的分解，小球藻细胞破壁更彻底，细胞内的叶黄素、小球藻生长因子和不饱和脂肪酸等营养物质能够直接被畜禽利用。小球藻粉经固态发酵，含有的有机酸等产物使饲料口感更好，消化酶等产物更有利畜禽消化吸收营养物质，有利提高小球藻饲料的销量及使用量；小球藻发酵饲料的生产，有助减少小球藻废液的排放，减少环保压力，增加小球藻生产企业的经济效益；小球藻能够利用工业化装置大批生产，固态发酵工艺成熟、生产成本低，能够缓解饲料生产过程中的原料来源、生产成本问题。4结论本研究将异养小球藻复合培养基经固态发酵后制得发酵饲料，能够解决饲料原料来源问题。异养小球藻发酵饲料可以改善仔猪肠道菌群，降低仔猪腹泻率；显著提高仔猪的平均日采食量、平均日增重，降低料重比；显著提高仔猪的免疫功能，提升仔猪的营养状况和健康水平，产生明显的经济效益和社会效益。