近年来，因水产养殖环境恶化导致水生动物细菌性疾病频发[1-2]。水生动物的细菌性疾病多见于弧菌病。溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）可以引起鱼、贝、虾等养殖动物出现败血症、体表溃疡、出血和鳍间组织溃烂等病变[3]。因此，预防和控制细菌疾病是水产养殖过程中的一个主要问题。红树林生长在海陆交错地区的植物群落，在调节海水中的菌群、提供营养物质、维护物种多样性等方面具有重要作用[4]。芽孢杆菌作为红树林根部土壤中常见的益生菌群[5]，可产生耐高温、耐干旱、抵抗紫外线的芽孢，繁殖能力强，生长的过程中会产生天然化合物、淀粉酶、信号分子等多种物质[6]，其抗菌活性物质通过诱导细胞凋亡、抑制细胞壁及蛋白质的合成、攻击胞膜和线粒体等作用方式抑制病原菌生长繁殖[7]。本试验在湛江海域的红树林地区采集根部泥土进行芽孢杆菌分离，以溶藻弧菌HY9901为指示菌从其中筛选出1株对其抑制效果明显的菌株，通过对拮抗菌株的生物学特性进行分析，为弧菌病的防治提供新思路，为该拮抗菌株在水产养殖方面的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用117株菌株均来自广东湛江红树林地区的泥土。溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901采自广东湛江海域患病的红笛鲷鱼（Lutjanus sanguineus）；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、海豚链球菌（Streptococcus iniae）均保存于广东省水产经济动物疾病防治重点实验室。LB、BHI、TSA培养基购自海博生物技术有限公司。1.2拮抗菌株的分离在广东湛江的红树林根部采集地表5 cm以下的泥土放入锥形瓶，加入30 mL无菌蒸馏水，37 ℃、150 r/min恒温振荡培养箱中使土壤充分悬浮，10 min后取出；80 ℃水浴15 min，使芽孢杆菌以外的杂菌灭活。无菌蒸馏水梯度稀释处理后的土壤悬浮液均匀涂布于BHI固体培养基，37 ℃培养过夜。挑取单菌落纯化3次，-80 ℃保存。1.3拮抗菌株的筛选1.3.1拮抗菌株的初筛利用平板对峙法对分离到的菌株进行初步筛选。将保存的菌株和HY9901分别接种于新鲜的培养基中过夜培养，进行活化并调整其菌浓度为1×107 CFU/mL。在BHI固体培养基上均匀贴上空白纸片，以HY9901为指示菌并添加在平板中央，在其周围添加待筛选的菌株各10 μL，培养过夜。观察待筛选菌株的抑菌情况，初步筛选出对HY9901具有拮抗作用的菌株。1.3.2拮抗菌株的复筛采用杯碟法对具有拮抗作用的菌株进一步筛选。将1.3.1获得的菌株37 ℃、150 r/min振荡培养1 w，离心取上清液，采用0.22 μm滤膜过滤获得各个菌株的无细胞发酵上清液（CFS）。高温灭菌并冷却至40 ℃的TSA培养基中加入HY9901，使其终浓度为1×106 CFU/mL并倒入平皿中，待凝固后在中央打孔。取各个菌株的CFS 100 μL注入孔内，37 ℃培养24 h观察抑菌结果。选取对HY9901拮抗效果较好的3个对峙平板，挑取平板上的HY9901于无菌PBS中制成菌悬液，并使其菌浓度为1×108 CFU/mL，取1 mL菌悬液4 000 r/min离心10 min，使用0.1 mol/L PBS冲洗，固定液进行固定，梯度乙醇进行脱水，使用无水乙醇重悬后取5~10 μL重悬液滴加于玻片表面，将玻片干燥喷金，采用扫描电镜（SEM）观察细胞形态。1.4测定指标及方法1.4.1拮抗菌株的鉴定1.4.1.1形态观察和生理生化特征检测根据1.3的结果，挑选出对HY9901抑制效果最好的拮抗菌株，在固体培养基上划线培养，观察其菌落形态，并在液体培养基中观察其生长状态。参照《常见细菌鉴定手册》所述的方法对拮抗菌株的生理生化特征进行检测[8]。1.4.1.2分子生物学鉴定以拮抗菌株的总DNA为模板对16S rDNA进行PCR扩增并测序。在NCBI中将测序结果进行BLAST比对，选取相似性较高的菌株序列，使用MEGA7构建系统发育树。1.4.2拮抗菌株培养条件优化将保存的拮抗菌株分别接种于BHI、LB、TSB培养基进行培养，通过测量不同时间点的OD600 nm值，绘制生长曲线，以挑选出拮抗菌株的最佳培养基。通过单因素试验依次对培养温度（22、27、32、37、42 ℃）、NaCl含量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、装载量（10%、20%、30%、40%、50%）、初始酸碱度（pH值5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）进行优化，分析不同培养条件下对拮抗菌株菌体量的影响，确定最佳培养条件。1.4.3拮抗菌株的抑菌能力测定拮抗菌株过夜培养，调整菌浓度为1×107 CFU/mL，采用1.3.2的方法获取拮抗菌株的CFS，分别保存于4 ℃冰箱。选取6种常见的病原指示菌添加到高温灭菌，冷却至40 ℃的TSA培养基中，终浓度为1×107 CFU/mL倒入平皿中，待凝固后在其中央打孔。在孔内添加拮抗菌株的菌悬液和CFS 100 μL，37 ℃培养24 h观察其抑菌结果，并用游标卡尺测量其抑菌圈直径。1.4.4拮抗菌株的安全性评价及保护效率1.4.4.1溶血试验将无菌脱纤维绵羊血（北京索莱宝科技有限公司）添加在琼脂培养基中，使其浓度为5%。将拮抗菌株过夜培养后调整其菌浓度为1×108 CFU/mL，吸取100 μL涂布于绵羊血琼脂平板上，观察拮抗菌株是否产生溶血圈。1.4.4.2斑马鱼毒性试验设置5个试验组，每组3个重复，每桶养殖水体100 L、30尾斑马鱼，试验桶添加拮抗菌株，终浓度分别为0、102、104、106、108 CFU/mL。前2 d每隔3 h观察1次鱼体的健康情况，之后每隔12 h观察一次，观察7 d。1.4.4.3拮抗菌株的保护效果为评估拮抗菌株对水产养殖动物的保护率，设置3个试验组。第1组添加拮抗菌株，拮抗菌的终浓度为1×106 CFU/mL；第2组添加HY9901，HY9901的终浓度为1×106 CFU/mL；第3组添加拮抗菌株与HY9901，各菌体的终浓度均为1×106 CFU/mL。计算7 d后斑马鱼的存活率。2结果与分析2.1拮抗菌株的分离与筛选（见图1）由图1可知，从采集的样品中分离细菌117株，利用平板对峙法进行初步筛选，获得8株对HY9901具有拮抗作用的菌株。利用杯碟法和扫描电镜进行复筛，最终获得1株对HY9901具有明显拮抗作用的菌株，命名为ZJ2009。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.F001图1ZJ2009菌株对溶藻弧菌HY9901的拮抗效果2.2拮抗菌株的鉴定2.2.1ZJ2009菌株的菌落形态（见图2）由图2可知，ZJ2009菌株在BHI固体培养基上为淡黄色菌落，边缘呈锯齿状，菌体表面粗糙且无色素产生；BHI液体培养基振荡培养并静止一段时间有菌膜形成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.F002图2ZJ2009菌株的菌落形态2.2.2ZJ2009菌株生理生化检测（见表1）由表1可知，根据ZJ2009菌株的20项生理生化检测结果，可初步确定为解淀粉芽孢杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.T001表1ZJ2009菌株的生理生化检测项目结果项目结果革兰氏染色+枸橼酸盐利用试验-淀粉水解+柠檬酸盐利用试验+明胶液化+硝酸盐还原试验-脲酶-硫化氢试验-苯丙氨酸脱氨酶-MR-葡萄糖+V-P-蔗糖+3%NaCl+过氧化氢酶+5%NaCl+精氨酸双水解酶-7%NaCl+吲哚试验-10%NaCl+注：“＋”表示测定结果为阳性，“-”表示测定结果为阴性。2.2.3分子生物学鉴定（见图3）由图3可知，ZJ2009菌株的16S rDNA经PCR扩增测序，经对比，与解淀粉芽孢杆菌的基因序列有99%以上的相似度。ZJ2009菌株与解淀粉芽孢杆菌同属一个分支。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.F003图3基于16S rDNA基因序列构建的ZJ2009菌株的系统发育树结合上述鉴定方法，可确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。将ZJ2009菌株的16S rDNA测序结果上传至NCBI，GenBank登录号为OK050184。2.3拮抗菌株的培养条优化（见图4）由图4可知，通过测量在不同培养基中ZJ2009菌株的生长曲线，可以得出ZJ2009菌株在4 h时进入对数生长期，12 h后ZJ2009菌株的生长逐渐趋于稳定。图4ZJ2009菌株培养条件优化（n=3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.F4a1（a）培养基对细菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.F4a2（b）温度对细菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.F4a3（c）NaCl含量对细菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.F4a4（d）装载量对细菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.F4a5（e）pH值对细菌生长的影响由图4可知，ZJ2009菌株在BHI培养基中培养最佳；在22~42 ℃内，ZJ2009菌株均能够生长，但在22 ℃时生长较为缓慢，37 ℃生长最佳；NaCl含量在0.5%~2.5%时，ZJ2009菌株均能够较好生长，但在NaCl含量为1.5%时生长最佳。在培养基装载量为10%和20%时，ZJ2009菌株的生长较好，但随装载量的增大，菌株生长变得缓慢；ZJ2009菌株的生长受pH值的影响较大，在培养基的初始pH值为6.0~8.0时才能较好生长。结果表明，ZJ2009菌株的最佳培养条件为装载量10%~20%，pH值6.0~8.0、添加1.5% NaCl的BHI培养基37 ℃培养12 h以上。2.4拮抗菌株的抑菌谱测定（见表2）由表2可知，ZJ2009菌株对6种水生动物病原菌均具有明显的抑制作用，CFS对6种病原菌的抑制效果比ZJ2009菌株菌体的抑制效果较好。表明ZJ2009菌株具有良好的广谱抗菌性且是通过某些代谢产物抑制病原菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.T002表2ZJ2009菌株菌体及CFS对6株指示菌的抑菌效果指示菌抑菌圈直径ZJ2009菌株ZJ2009菌株CFS副溶血弧菌15.5±0.316.9±0.1哈维氏弧菌13.0±0.214.5±0.1嗜水气单胞菌10.9±0.511.8±0.4铜绿假单胞菌9.0±0.310.1±0.4无乳链球菌11.5±0.212.5±0.1海豚链球菌8.6±0.39.5±0.4mm2.5拮抗菌株的安全性评价及保护效果（见图5）由图5可知，将ZJ2009菌株涂布于含5%绵羊血的琼脂平板上，无溶血环产生。水体中ZJ2009菌株的菌浓度为0、102、104、106、108 CFU/mL时，斑马鱼均未出现死亡，活动能力正常，表明ZJ2009菌株对斑马鱼安全、无毒副作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.10.015.F005图5ZJ2009菌株的保护效果评价（n=3）注：“*”表示差异显著（P0.05）；“**”表示差异极显著（P0.01）。拮抗菌株的保护效果试验表明，添加一定数量的拮抗菌确实能够降低溶藻弧菌的感染率。在感染溶藻弧菌后7 d斑马鱼的存活率为（13.8±0.8）%，但在感染溶藻弧菌的试验桶中加入ZJ2009菌株，斑马鱼的存活率为（50.4±1.2）%。3讨论弧菌病一经爆发会引起水产养殖动物的大面积死亡[9]，水产养殖者也会蒙受巨大的经济损失[10]。近年来，由于水产养殖业的不断发展壮大以及抗生素的滥用，导致多数病原菌产生不同程度的耐药性，甚至发展为超级细菌，因此，微生态制剂成为解决抗生素问题的手段之一[11]。芽孢杆菌作为微生态制剂之一，已被广泛应用于水产养殖行业中[12]。将微生态制剂添加到水产饲料中，对水生动物体内的病原微生物具有一定的抑制作用，能够提高水生动物的机体免疫力，促进水生动物的生长繁殖，且无污染、无毒副作用，给水产养殖行业带来较好的生态效益[13]。解淀粉芽孢杆菌因其繁殖速度快、抗逆能力强、培养要求简单、抗菌谱较为广泛以及具有多种不同作用方式等，成为目前芽孢杆菌研究的对象之一[14]。Altemeier等[15]通过酸沉淀、甲醇提取方法，从解淀粉芽孢杆菌的发酵上清液中获得多种环脂肽类抑菌物质。解淀粉芽孢杆菌的代谢产物可直接或间接造成病原菌细胞结构损伤，抑制生长发育[16]。Shahzad等[17]发现解淀粉芽孢杆菌RWL-1菌株可通过调节番茄体内激素和氨基酸的水平，抑制病原性尖孢镰刀菌在番茄体内生长。潘虹余等[18]利用解淀粉芽孢杆菌B15菌株的发酵液对灰霉病菌作用，通过激光共聚焦显微镜观察，发现处理后的灰霉菌发生细胞凋亡、染色质收缩、细胞核破裂等现象，解释抑菌物质的作用机理。本研究对解淀粉芽孢杆菌的保护效果进行试验，发现对受感染的斑马鱼的保护率可达37%。Hamza等[19]研究表明，经地衣芽孢杆菌的CFS处理后感染溶藻弧菌的卤虫的存活率为(65.83±4.91)%。Niu等[20]发现一株芽孢杆菌可以保护丰年幼虫免受坎氏弧菌（Vibrio campbellii）的感染，受感染的丰年幼虫的存活率可达70%以上。Abasolo-Pacheco等[21]研究表明，芽孢杆菌和乳酸菌作为益生菌可以有效地保护海湾扇贝免受溶藻弧菌的感染。研究结果揭示芽孢杆菌菌株在控制水产养殖场细菌感染方面的重要作用。河南郑州市水产技术推广站将枯草芽孢杆菌应用到水产饲料中，鱼塘用药量明显下降，水质条件得到改善，提高饲料原料转化率和鱼体生产性能[22]。覃初斌等[23]研究表明，在饲料中添加解淀粉芽孢杆菌，可促进黑鲷幼鱼的生长、提高其抗氧化应激的能力，并使其肠道内环境得到改善。ZJ2009菌株抑菌效果较好且无溶血现象，可作为水产饲料添加剂的候选益生菌株，但对安全性需要进行更深入的评价，对具体的应用效果仍需深入研究。4结论本试验从红树林土壤中筛选出1株对溶藻弧菌HY9901具有较强抑制作用的解淀粉芽孢杆菌ZJ2009，通过对其生物学特性进行研究，确定ZJ2009菌株的最佳培养条件，菌株抗菌谱广，具有一定的安全性且有较高的保护率，在水产养殖行业具有广阔的应用前景。