近年来，为满足动物的生产需求，高氮、高能饲粮已成为畜牧业的主要养殖模式。反刍动物通过摄入并降解饲粮中的碳水化合物和粗蛋白质，从而满足机体的能量和蛋白质需求。饲粮中粗蛋白质水平过高会使过量的氮排出体外，污染环境；过低会使瘤胃中氨氮浓度减少，从而影响动物的生产性能[1-2]。淀粉是高谷物饲粮的重要能源物质，增加淀粉含量和易发酵碳水化合物是提高饲粮能量水平的主要方式[3]。饲粮中能量和蛋白的平衡供给是反刍动物营养研究的热点。徐欣等[4]研究表明，提高饲粮中淀粉含量可对生长期肉牛瘤胃发酵产生消极影响；当肉牛在6月龄以上时，饲粮中淀粉含量在40%左右为宜，过高可能引发亚急性瘤胃酸中毒。陈跃凤[5]发现，高蛋白和高淀粉饲粮可显著提高瘤胃液中微生物蛋白含量，高淀粉日粮可以显著降低氨态氮浓度，高蛋白和淀粉的互作只对乙酸具有极显著影响。韩璐璐[6]研究发现，蛋白质的摄入量与氨态氮的浓度呈正相关，对VFA含量影响不显著。反刍动物在不同的生长时期对蛋白质和能量的需求不同，调控配方中原料比例改变发酵底物的粗蛋白质水平和淀粉含量对反刍动物瘤胃发酵的影响仍需进一步研究。体外培养法是将特殊处理过的瘤胃液与需要发酵的底物进行体外短期发酵，模拟瘤胃对营养物质的消化利用过程，该方法操作简单、重复性好，可在实验室条件下进行研究，得到了广泛应用[7]。本试验采用体外发酵试验，探究粗蛋白质和淀粉水平对瘤胃发酵特性的影响，为反刍动物饲粮中合理配制提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验采用2×3双因素试验设计：饲粮粗蛋白质（CP）水平为10.50%、13.00%，淀粉（ST）水平分别为20.00%、30.00%、40.00%。设A~F共6组，每组3个重复。试验饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.001.T001表1试验饲粮组成及营养水平（风干基础）项目10.50% CP13.00% CPA组B组C组D组E组F组原料组成/%全株玉米青贮53.0026.504.1345.8321.403.06麦秸2.052.162.236.006.003.28大豆皮25.1027.0026.0017.0017.5417.00豆粕1.581.241.108.338.067.54玉米2.5227.4050.843.8428.0050.12玉米皮5.755.705.704.004.004.00玉米胚芽粕10.0010.0010.0015.0015.0015.00合计100.00100.00100.00100.00100.00100.00营养水平综合净能/(MJ/kg)5.927.168.246.047.218.27粗蛋白/%5.927.168.246.047.218.27粗脂肪/%3.863.733.583.503.363.26中性洗涤纤维/%43.7037.2630.4340.8334.1926.96酸性洗涤纤维/%26.0021.6816.8923.3618.8113.79淀粉/%20.0030.0040.0020.0030.0040.00注：营养水平中综合净能为计算值，其余均为实测值。1.2瘤胃液供体牛的饲养管理选取3头体况良好、体重相近、安装永久性瘤胃瘘管的荷斯坦阉牛为瘤胃液供体动物，饲粮配方参照NRC（2001）和牛场配方。试验牛散栏饲养，每日饲喂2次，自由饮水。饲粮组成为：玉米秸秆青贮40.00%、玉米42.02%、豆粕3.86%、棉粕3.60%、DDGS 8.85%、石粉0.44%、预混料0.14%、小苏打0.79%、食盐0.30%，由保定满城宏达牧场提供。1.3体外产气法1.3.1试验仪器人工瘤胃装置由100 mL体外产气瓶、HT-935专业差压测量仪（广州市宏诚集业电子科技有限公司）、恒温气浴振荡器（广东中山医疗器械厂）、恒温水浴锅（江苏金坛医疗仪器厂）、二氧化碳罐等。1.3.2人工瘤胃缓冲液配制人工瘤胃缓冲液按照Goering等[2]和Van等[8]方法配制。520 mL蒸馏水、0.1 mL微量元素溶液（A液）、208.1 mL缓冲溶液（B液）、208 mL常量元素溶液（C液）、1.0 mL刃天青溶液（D液），加入62.4 mL还原剂溶液（E液），混匀，39 ℃恒温水浴，通入CO2，至混合液淡蓝色褪去，接近无色。1.3.3体外发酵准确称量0.5 g发酵底物于ANKOM F572纤维袋，放入100 mL发酵瓶，39 ℃温气浴振荡器中进行预热处理。瘘管牛晨饲前采集瘤胃液，经4层纱布过滤至提前预热保温瓶中，过滤期间不断往保温瓶通入CO2。将瘤胃液与人工瘤胃缓冲液按体积比1∶3混匀，取60 mL倒入提前预热的发酵瓶中（厌氧条件下进行），做空白对照，进行发酵。当培养至2、4、6、8、16、24、36、48 h时测定发酵瓶中的产气值。培养48 h，取出发酵瓶，测定pH值，放入冰水；终止发酵，将发酵液分装至10 mL离心管，测定发酵参数；纤维袋以清水洗净，65 ℃烘箱48 h，称重，测定干物质降解率。1.4测定指标及方法1.4.1饲料常规营养成分试验原料于65 ℃烘48 h，粉碎为10目和40目，参照张丽英[9]方法对原料干物质（DM）、粗蛋白（CP）等指标进行测定；按布仁贺希格等[10]方法随原料中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）；淀粉含量采用高氯酸水解-蒽酮比色法进行测定。1.4.2干物质降解率、瘤胃发酵参数利用UB-7型酸度计（美国）测定瘤胃液pH值；参照冯宗慈[11]方法测定发酵液NH3-N的浓度；采用考马斯亮蓝法测定发酵液MCP的浓度；使用气相色谱仪7890 A测定挥发性脂肪酸的浓度。干物质降解率(DMD)=(降解前样品重量×降解前样品干物质含量－降解后样品重量×降解后样品干物质含量)/(降解前样品重量×降解前样品干物质含量)(1)1.4.3产气量使用HT-935专业压差测量仪记录产气量发酵瓶压力值（Psi），每次测量完毕排空发酵瓶中气体，发酵48 h，通过空白瓶校正，计算累计产气量。GP=0.18+3.697 Pt+0.082 4 Pt2 (2)式中：GP为t时间总产气体积（mL）；Pt为t时间压力值。1.5数据统计与分析试验数据采用SAS 9.2软件MIXED模型进行统计分析，采用最小二乘均值法（LS MEANS）进行显著性比较。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1饲粮中粗蛋白质和淀粉水平对体外产气量与产气参数的影响（见表2）由表2可知，粗蛋白质水平和淀粉含量对体外24 h、48 h产气量和产气参数均具有显著影响（P0.05），且粗蛋白质水平和淀粉含量呈显著的互作效应（P0.05）。当CP含量为10.50%时，B组、C组的产气量和产期参数差异不显著（P0.05）；当CP含量为13.00%时，产气量和产期参数随淀粉含量的增加而显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.001.T002表2饲粮中粗蛋白质和淀粉水平对体外产气参数的影响项目10.50% CP13.00% CPSEMP值A组B组C组D组E组F组CPSTC×S24 h产气量/mL107.90e143.56b142.54b110.33d133.61c146.42a0.180.010.010.0148 h产气量/mL126.20e155.07b155.98b137.08d150.66c169.54a0.170.010.010.01a+b/mL126.12e157.74b157.75b136.65d151.37c175.92a0.240.010.010.01c/(%/h)0.070 8e0.084 6b0.083 2b0.072 3d0.082 9c0.095 5a0.000.010.010.01注：1.同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.a+b为潜在产气量；c为慢速产气部分的产气速度常数。2.2饲粮中粗蛋白质和淀粉水平对体外发酵参数的影响（见表3）由表3可知，当CP含量为10.50%时，B组与C组的DMD差异不显著（P0.05）；当CP含量为13.00%时，DMD随着饲粮中淀粉含量的增加而升高，且CP含量为13.00%时各淀粉含量组的DMD显著高于CP含量为10.50%时各淀粉含量组（P0.05）。当CP含量为10.50%时，C组的pH值显著低于低淀粉含量组（P0.05）。发酵液中NH3-N浓度随着淀粉含量的增加而降低。CP含量为10.50%时，A组的NH3-N浓度显著高于B组、C组（P0.05）；CP含量为13.00%时，A组、B组NH3-N浓度显著高于C组（P0.05）。发酵液中MCP浓度随淀粉含量的增加而升高，在CP含量为13.00% C组的MCP浓度最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.001.T003表3饲粮中粗蛋白质和淀粉水平对体外发酵参数的影响项目10.50% CP13.00% CPSEMP值A组B组C组D组E组F组CPSTC×SDMD/%75.10e80.12d80.75d82.30c85.24b86.98a0.350.010.010.01pH值6.54a6.34b6.29b6.30b6.28b6.22c0.010.010.010.36NH3-N/(mg/L)134.70a129.00b125.80b136.50a133.40a129.30b0.120.010.010.56MCP/(mg/L)2 309.60c2 375.20bc2 422.20ab2 326.50c2 448.40ab2 482.30a2.510.030.010.522.3饲粮中粗蛋白质和淀粉水平对体外挥发性脂肪酸浓度的影响（见表4）由表4可知，发酵底物中粗蛋白质水平对挥发性脂肪酸的浓度无显著影响（P0.05）。发酵液中乙酸浓度和乙酸与丙酸比值均随淀粉含量的增加而显著降低（P0.05）。在CP含量为13.00%时，丙酸浓度随着饲粮淀粉含量的增加而显著升高（P0.05）；CP含量为10.50%时，B组和C组的丙酸浓度差异不显著(P0.05)。CP含量为10.50%时，丁酸浓度随淀粉含量的增加而显著升高（P0.05）；CP含量为13.00%时，E组和F组的丁酸浓度差异不显著(P0.05)。CP含量为10.50%时B组与CP含量为13.00%时F组的总挥发性脂肪酸均显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.13.001.T004表4饲粮中粗蛋白质和淀粉水平对挥发性脂肪酸的影响项目10.50% CP13.00% CPSEMP值A组B组C组D组E组F组CPSTC×S乙酸/(mmol/L)80.94a76.31b74.02c80.82a75.91b74.77c0.260.780.010.94丙酸/(mmol/L)32.36c38.44a39.09a32.89c36.83b39.93a0.340.200.010.82丁酸/(mmol/L)15.65c15.97b16.34a15.72c16.29a16.30a0.140.310.010.41总挥发性脂肪酸/(mmol/L)128.95c130.72a129.45b129.43b129.03bc131.00a0.430.240.010.98乙酸/丙酸2.50a1.99b1.89c2.46a2.06b1.87c0.020.230.010.783讨论3.1饲粮中粗蛋白质和淀粉水平对体外产气量、产气参数和干物质降解率的影响反刍动物瘤胃中微生物菌系利用营养物质可产生气体（CO2、NH3、CH4等）、短链脂肪酸（SCFA）和微生物产物。产气量是衡量厌氧微生物利用底物中营养成分的发酵动态，可通过产气量的变化估测底物的消化水平和速率[12]。张鹏飞等[13]研究饲粮中不同结构性碳水化合物（SC）与非结构性碳水化合物（NSC）比例对瘤胃体外发酵的影响，结果发现，增大NSC的比例，最大产气量可显著增加，且随着SC∶NSC值的降低产气速率呈上升趋势。Zebeli等[14]研究发现，体外产气量与饲料中碳水化合物的利用程度呈强相关，淀粉的降解水平会影响发酵产气量。本试验中，蛋白水平一定时，随着淀粉含量的增加，24、48 h产气量和潜在产气量显著升高，与上述研究结果一致[13-14]。淀粉含量一定时，随着蛋白水平的增加，中、高淀粉含量组的24、48 h产气量和潜在产气量并无显著影响，而Dung等[15]利用体外发酵技术发现产气量随粗蛋白水平的升高而减少，与本试验研究结果并不一致，可能因为发酵底物的组成成分不同，影响微生物区系对底物的利用效率。体外产气法测定的底物利用程度与在反刍动物活体内测定的结果呈高度正相关[16]。通过底物发酵前的重量与发酵后的残余量和发酵产物生成量测定底物的降解程度，实现对饲料的利用率和营养价值的评定。Cheema等[17]研究发现，提高饲粮中粗蛋白质水平可增加瘤胃微生物的数量，增强微生物的活性，提高对饲粮干物质的消化率，与本试验结果相似。张相伦等[18]与Broderick[19]研究表明，饲粮中粗蛋白质水平的升高对干物质消化率无显著影响，可能因为饲粮中蛋白水平升高，对能氮平衡产生影响，限制瘤胃微生物对营养物质的消化。本试验中，当饲粮中粗蛋白质水平一定时，增加淀粉含量，可显著提高底物干物质降解率，与李满全[20]利用体外培养液探究SC∶NSC比例对干物质消失率的结果相似，随着非结构性碳水化合物比例的增大，干物质的消失率呈升高的趋势。3.2饲粮中粗蛋白质和淀粉水平对体外瘤胃发酵参数的影响瘤胃液pH值是反映瘤胃发酵情况的综合指标，受微生物区系状况、瘤胃中VFA及其他有机酸的含量、饲粮性质等因素影响。本试验中，各处理组48 h发酵液pH值在6.22~6.34，均在正常生理范围内（5.5~7.5）[21]，且蛋白和淀粉对瘤胃pH值均具有显著性影响，当淀粉含量一定时，提高CP含量可显著降低瘤胃pH值。马露等[22]发现饲喂不同CP水平饲粮对瘤胃pH值影响不一致，可能因为饲粮组分的差异和蛋白水平的不同等。本试验中，当蛋白水平一定时，瘤胃pH值随淀粉含量的升高而显著降低，与前人研究一致[13]。NH3-N浓度是表征瘤胃微生物对营养物质中氮的利用和瘤胃微生物合成代谢MCP的主要指标。Nsahlai等[23]研究发现，瘤胃液中NH3N浓度与发酵底物蛋白水平呈正相关，但底物淀粉含量越高，蛋白降解率越低。本试验中，当蛋白水平一定时，增加饲粮中淀粉含量可降低发酵液中NH3N浓度，可能因为底物中淀粉含量的增加，抑制瘤胃微生物降解蛋白质产生NH3-N。瘤胃中MCP含量是衡量瘤胃微生物对营养物质中氮的利用效率的主要指标。研究发现，MCP的合成主要取决瘤胃微生物对碳水化合物和蛋白质的利用效率，当瘤胃中能氮释放速率不平衡时，MCP的合成会降低[24-25]。本试验中，提高饲粮中蛋白水平可显著增加MCP浓度，但提高淀粉含量对MCP的浓度影响不一致。本试验中，当CP水平为10.50%时，低、中淀粉含量组MCP浓度显著低于高淀粉含量组，当CP水平为13.00%时，低淀粉含量组显著低于中、高淀粉含量组，且中、高淀粉含量组之间差异不显著。反刍动物瘤胃中VFA主要由乙酸、丙酸、丁酸及其他短链脂肪酸组成，瘤胃VFA的成分、产量和比例主要受饲粮组分的影响，同时也是评价瘤胃发酵能力和方式的重要指标。本试验中，当淀粉含量一定时，提高饲粮中蛋白水平对发酵液中乙酸、丙酸、丁酸影响不大，与Norrapoke等[26]研究结果相似。本试验中，当蛋白水平一定时，增加饲粮中淀粉含量可显著提高丙酸浓度，乙酸浓度显著降低，乙酸与丙酸的比值减小，对丁酸无显著影响，说明增加饲粮中淀粉含量可使瘤胃由乙酸型发酵向丙酸型发酵转变。4结论适当提高饲粮中蛋白水平有助于提高产气量、干物质降解率和MCP浓度；当蛋白水平升高时，提高淀粉水平对体外瘤胃发酵参数具有一定的改善。通过干物质降解率等各项指标分析比较，在较低蛋白饲粮条件下，淀粉水平在30%~40%范围内的体外瘤胃发酵效果较好。