小麦是家禽日粮饲料主要成分之一。与玉米相比，小麦的营养优点是蛋白质、钙、磷及除亮氨酸外氨基酸的含量较高，缺点是非淀粉多糖（包括纤维素、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖）含量高[1]。非淀粉多糖会增加肠道内容物黏度，阻止内源酶对饲料的酶解[2]。一般为消除非淀粉多糖对单胃动物营养利用产生负面影响，通常会将降解非淀粉多糖的饲料酶添加在以小麦为基础的饮食中。此外，因家禽无唾液淀粉酶，淀粉十二指肠和空肠中的内源α-淀粉酶分解[3]，添加外源淀粉酶可补充内源酶的不足，提高淀粉及其他营养物质的消化率[4]。与玉米相比，小麦也具有一定的成本优势[5-6]。选用优质复合酶提高小麦可利用能量，降低抗营养因子含量，对提高动物消化吸收起重要作用。与动物试验相比，体外消化酶解试验具有成本效益、快速和可重复性特点。本试验通过筛选酶制剂并对其配方优化，以期提高小麦的代谢能，缩小小麦和玉米的原料质量差异，提升肉鸡小麦饲料品质，降低饲料成本，促进饲料配方多元化发展。1材料与方法1.1试验日粮试验日粮为22~42日龄肉鸡小麦型饲料，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米40.00代谢能/(MJ/kg)11.97小麦25.00粗蛋白质/%19.48豆粕29.80粗纤维/%3.20石粉1.25粗灰分/%5.28磷酸氢钙1.50粗脂肪/%3.75蛋氨酸0.11钙/%0.90赖氨酸0.04总磷/%0.63氯化钠0.30禽有效磷/%0.39预混料0.50氯化钠/%0.34豆油1.50赖氨酸/%1.01蛋氨酸+半胱氨酸/%0.75蛋氨酸/%0.41苏氨酸/%0.71注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 5 000 IU、VD 800 IU、VE 10 IU、VK 0.5 mg、硫胺素2 mg、核黄素5 mg、泛酸10 mg、烟酸30 mg、吡哆醇3 mg、VB12 0.01 mg、生物素0.15 mg、叶酸0.55 mg、铜7 mg、铁80 mg、锰95 mg、锌80 mg、碘0.6 mg、硒0.3 mg。2.营养水平均为计算值。1.2试剂与设备主要试剂：试剂均为分析纯，试验用水为纯化水。磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸（国药集团）；P7000胃蛋白酶、P7545-25G胰液素（sigma公司）；30万U/g木聚糖酶、1万U/g纤维素酶、3万U/g β-葡聚糖酶、700 U/g α-淀粉酶（武汉新华扬生物股份有限公司）；纯化水稀释100倍。主要设备：FA2004分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、LNGT-SB-094水浴恒温振荡器（天津欧诺仪器仪表有限公司）、pH计（梅特勒）、TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、QP-01真空抽滤泵（北京元弘科技有限公司）。1.3试验方法1.3.1胃蛋白酶-胰酶体外消化酶解小麦型饲料过40目标准筛，称取10.0 g，加25 mL纯化水搅拌均匀，加入相应酶制剂或酶制剂组合。参照单春乔等[7]方法进行体外胃、肠道消化模拟试验，胃消化pH值3.0，肠道消化pH值6.6，消化结束对饲料进行抽滤，滤液用纯化水定容至100 mL，DNS法测还原糖含量。1.3.2单因素试验单因素试验设计见表2，研究木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶及α-淀粉酶对酶解后还原糖的影响，选取影响最大的纤维素酶、β-葡聚糖酶及α-淀粉酶进行3因素3水平进行响应面设计，酶制剂按照底物质量分数添加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.T002表2单因素试验设计项目酶添加量木聚糖酶00.003 60.007 10.010 70.014 30.017 9纤维素酶00.004 50.009 10.013 60.018 20.022 7β-葡聚糖酶00.006 70.013 30.020 00.026 70.033 3α-淀粉酶00.046 00.092 00.137 90.183 90.229 9mg/g1.3.3响应面优化根据单因素试验，采用Design-Expert V8.0.6进行响应面设计，还原糖为指标优化饲料的酶解工艺，响应面试验设计见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.T003表3响应面试验设计水平纤维素酶（X1）β-葡聚糖酶（X2）α-淀粉酶（X3）-10.013 60.013 30.137 900.018 20.020 00.183 910.022 70.026 70.229 9mg/g1.3.4还原糖测定定容的酶解液在稀释一定倍数后，使用DNS分光光度法测还原糖含量，以还原糖含量为横坐标（mg），OD540 nm为纵坐标。1.4数据统计与分析采用Excel软件进行数据整理，Origin8.5软件作图，Design-Expert 8.0.6.1软件进行响应面设计分析。2结果与分析2.1不同酶制剂添加量对肉鸡小麦型饲料酶解的影响（见图1~图4）由图1可知，木聚糖酶添加量为0.007 1 mg/g时，还原糖含量最高，为101.41 mg，比木糖醇酶添加量为0时增加16.40%。肉鸡小麦饲料中木聚糖酶的最适添加量为0.007 1 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.F001图1木聚糖酶对还原糖含量的影响由图2可知，纤维素酶添加量为0.018 2 mg/g时，还原糖含量最高，为157.81 mg，比纤维素酶添加量为0时增加62.34%。肉鸡小麦日粮中纤维素酶的最适添加量为0.018 2 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.F002图2纤维素酶对还原糖含量的影响由图3可知，β-葡聚糖酶添加量为0.02 mg/g时，还原糖含量最高，为179.85 mg，比β-葡聚糖酶添加量为0时增加71.27%。肉鸡小麦饲料中β-葡聚糖酶的最适添加量为0.02 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.F003图3β-葡聚糖酶对还原糖含量的影响由图4可知，α-淀粉酶添加量为0.092 mg/g时，还原糖含量显著增加；在0.183 9 mg/g时达到最高点，为529.17 mg，比α-淀粉酶添加量为0时增加4.24倍。肉鸡小麦饲料中α-淀粉酶的最适添加量为0.183 9 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.F004图4α-淀粉酶对还原糖含量的影响2.2酶解肉鸡小麦型饲料酶制剂优化采用Box-Behnken Design（BBD）对影响酶解效果的还原糖的3个因素进行优化。BBD试验设计及结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.T004表4BBD试验设计及结果序号X1/(mg/g)X2/(mg/g)X3/(mg/g)还原糖（Y）/mg10.013 60.013 30.183 9540.5420.022 70.013 30.183 9564.3430.013 60.026 70.183 9570.3640.022 70.026 70.183 9605.5650.013 60.020 00.137 9548.7760.022 70.020 00.137 9564.7570.013 60.020 00.229 9571.9680.022 70.020 00.229 9607.9990.018 10.013 30.137 9576.91100.018 10.026 70.137 9568.26110.018 10.013 30.229 9556.80120.018 10.026 70.229 9617.80130.018 10.020 00.183 9644.25140.018 10.020 00.183 9636.88150.018 10.020 00.183 9633.71160.018 10.020 00.183 9627.20170.018 10.020 00.183 9640.10由表4可知，Design-Expert对表4中的数据进行多元回归拟合分析，得到体外消化酶解法酶解的还原糖与纤维素酶、β-葡聚糖酶和α-淀粉酶之间的关系模型为：Y=636.43+13.88X1+15.42X2+11.98X3+2.85X1X2+5.01X1X3+17.41X2X3-36.4X12-29.83X22-26.66X32。对模型进行方差分析，响应曲面回归模型方差分析见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.T005表5响应曲面回归模型方差分析项目平方和自由度均方F值P值显著性模型19 669.6192 185.5139.400.000 1**X11 540.3811 540.3827.770.001 2**X21 903.1411 903.1434.310.000 6**X31 148.6611 148.6620.710.002 6**X1X232.49132.490.590.469 1X1X3100.501100.501.810.220 3X2X31 212.7811 212.7821.860.002 3**X125 579.2215 579.22100.570.000 1**X223 745.7713 745.7767.520.000 1**X322 992.4312 992.4353.940.000 2**残差388.32755.47失拟220.91373.641.760.293 5纯误差167.42441.85总和20 057.9316RAdj20.955 7注：**表示差异极显著（P0.01）。由表5可知，X1、X2、X3、X2X3、X12、X22、X32项达到非常显著的水平（P0.01），其他项对还原糖的影响不显著（P0.05）。比较各项的F值，对还原糖影响顺序依次为β-葡聚糖酶、纤维素酶、α-淀粉酶。该模型P值小于0.000 1，模型非常显著。失拟项为0.293 5，大于0.05，模型的拟合效果良好。模型的决定系数为0.955 7，表明建立的模型能很好拟合试验结果。对纤维素酶、β-葡聚糖酶和α-淀粉酶之间交互作用对体外消化酶解法的还原糖影响响应面分析。纤维素酶与β-葡聚糖酶交互作用、纤维素酶与α-淀粉酶交互作用对还原糖影响均不显著（P0.05），β-葡聚糖酶和α-淀粉酶对还原糖的影响显著（P0.05）。酶制剂间交互作用等高线、响应面见图5~图7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.F005图5β-葡聚糖酶和纤维素酶对还原糖影响的响应面和等高线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.F006图6纤维素酶和α-淀粉酶对还原糖影响的响应面和等高线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.020.F007图7α-淀粉酶和β-葡聚糖酶对还原糖影响的响应面图和等高线图当β-葡聚糖酶添加量不变时，随着α-淀粉酶的增加，还原糖先增加后减小；当α-淀粉酶不变时，还原糖随着β-葡聚糖酶先增加后减小。根据Design Expert 8.0.6软件分析，最佳酶解工艺为纤维素酶添加量0.192 mg/g、β-葡聚糖酶0.022 5 mg/g和α-淀粉酶浓度为0.200 8 mg/g。在该条件下，还原糖667.33 mg。在最优的条件下，进行3次平行试验，还原糖为665.68 mg，与预测值接近，表明利用响应面优化得到的数据准确可靠，具有实用价值。3讨论传统饲料玉米、豆粕型日粮中，玉米作为主要能量饲料约占日粮配方组成的60%；小麦因能量低、含较多的抗营养因子如非淀粉多糖、植酸等在饲料使用中被限制。与玉米相比，小麦在高蛋白、氨基酸含量及配比、钙磷含量以及内源植酸酶含量上具有一定的营养优势[8]。非淀粉多糖酶对小麦型饲料研究中，薛梅等[9]模拟单酶在体外胃肠液消化，β-葡聚糖酶添加量在150 U/g时，1~3周龄及4~6周龄肉鸡小麦型饲料还原糖最大，约为0.92 mg/g；纤维素酶添加量为950、960 U/g时，两种周龄饲料的还原糖约为0.93 mg/g。周传凤等[10]在饲料中添加复合含木聚糖酶850 U/g、纤维素酶750 U/g、β-葡聚糖酶50 U/g、植酸酶2 000 U/kg的酶制剂，添加量为2 000~2 500 mg/kg时，提高内源消化酶；添加量为2 000~3 000 mg/kg时，提高饲粮养分利用率。Dimitrios等[11]采用木聚糖酶和葡聚糖酶处理小麦可促进营养物质的消化率，尤其小肠中的淀粉和蛋白质的消化率，提高后肠的非淀粉多糖发酵率。Mohammad等[12]研究发现，以0.05%酶处理的小麦/大麦可达到增重、提高饲料转化率的效果。除直接添加酶制剂外，在肉鸡日粮中添加0.4%木酶固态发酵的酶粉（木聚糖酶487.96 U/g和纤维素酶18.55 U/g）可显著提高体重、饲料转化率、绒隐比、超氧化物歧化酶的活性、过氧化氢酶活性，改善肉鸡生产性能，增强抗氧化状态，并在提供最佳肠道环境方面表现良好，体重、饲料转化率、盲肠乳酸菌量主要体现在1~21日龄，酶制剂加入后的经济效益高于加入前[13]。在降低饲料配方含量方面，De等[14]研究表明，与标准配方相比，加入非淀粉多糖酶可以使配方中减少3%的总蛋白质和可消化氨基酸，且不影响肉鸡生产性能。此外，孙春阳等[15]研究表明，非淀粉多糖酶制剂的添加可以降低排泄物中氨气含量。淀粉酶对小麦型饲料研究中，马杰[16]发现，日粮中添加3 000 U/kg淀粉酶时肉鸡具有最大平均日增重，并显著提高食糜中α-淀粉酶的活性。在玉米型饲料研究中，Aderibigbe等[17]研究表明，淀粉的总消化率随着α-淀粉酶补充量的增加而增加，空肠食糜的黏度随日粮α-淀粉酶补充量的增加而降低，淀粉和能量的消化率以及外源淀粉酶的影响在后空肠处高于其他肠道部位。不同来源和浓度的淀粉酶对肉鸡具有不同影响，外源性淀粉酶可以通过影响肠道中的蔗糖酶和麦芽糖酶的活性，维持肠道的营养需求，绒毛高度/隐窝深度比，通过血浆葡萄糖转运蛋白mRNA表达的营养吸收和代谢，影响淀粉的消化率[18]。非淀粉多糖酶和淀粉酶对小麦型饲料研究中，Zhang等[19]研究发现，在不添加酶制剂的情况下将小麦和大麦添加到基于玉米大豆的饮食中，对肉鸡生长、回肠菌群绒毛形态、食糜黏度、胰酶活性和营养转运蛋白的基因表达水平具有不利影响，添加酶后可显著改善并恢复这些性状。木聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶、淀粉酶和葡糖淀粉酶添加到纯小麦基肉鸡日粮，可以显著提高中性洗涤纤维、淀粉、干物质和总能量的表观和真实消化率及表观代谢能和真代谢能，且在150 mg/kg添加量内呈线性关系。Neeraja等[20]体外回肠消化率法研究表明，小麦粉提取物的干物质消化率随着多酶（木聚糖酶、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶和蛋白酶）补充而定量增加。Hassan等[21]研究表明肉鸡整个生长周期内，酶处理的回肠脂肪表观消化率显著提高。Singh等[22]研究发现，木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶复合酶可以改善低纤维饮食中平均每日采食量。Liu等[23]研究表明，复合酶可以提高肉鸡对小麦的能量利用率和氮校正表观代谢能。在具有植酸酶小麦性饲料中，木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶的复合酶提高脂肪、蛋白质的表观回肠消化率以及表观回肠消化能，淀粉、脂肪和蛋白质响应外源酶的热量贡献受到基础谷物以及21、42日龄饲料纤维成分的不同而影响[24]。菌酶复合研究中，Dersjant等[25]研究表明，多酶（木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶）和芽孢杆菌组合作用提高肉鸡采食量和增重，改善垫料质量，降低脚垫损伤评分。在蛋鸡小麦型饲料研究中，非淀粉多糖酶和淀粉酶可以防止小麦对老年蛋鸡的骨矿化影响[26]，显著提高低能量饲料的蛋重[27]。本试验中，在筛选降解多糖酶制剂时，预试验发现木聚糖对饲料酶解效果不如纤维素酶和β-葡聚糖酶显著，酶解程度16.40%，对另一种小麦饲料酶解程度达到32%。针对此现象，Smeets等[28]体外消化法研究木聚糖酶对150个不同批次小麦的酶解效果发现，小麦对木聚糖酶的反应因不同批次而异；在可溶性非淀粉多糖研究中发现，阿拉伯木聚糖总含量与水解度无严格的相关性。阿拉伯糖与木糖的比率可以预测木聚糖酶的反应，较高的比率时对木聚糖酶降解的敏感性较低。Cardoso等[29]研究表明，外源酶内切1,4-β-木聚糖酶仅对具有高水平提取物黏度和低内源性内源1,4-β-木聚糖酶活性（347.0 U/kg）日粮中存在的小麦有效。提取物黏度和/或内源性内切1,4-β-木聚糖酶活性影响以小麦为基础喂养的家禽对外源性酶的反应。盲目选择木聚糖酶可能会导致肉鸡对营养物质的利用受限，需根据饲料原料筛选适用的酶制剂类型。4结论试验采用体外消化酶解法，模拟小麦型饲料在胃肠的消化并对酶解工艺进行优化。单酶的酶解研究显示，纤维素酶、β-葡聚糖酶和α-淀粉酶酶解效果最好；纤维素酶添加量0.019 2 mg/g、β-葡聚糖酶0.022 5 mg/g、α-淀粉酶浓度0.200 9 mg/g的条件下，还原糖643.156 mg，与预测值接近。因此，酶制剂选择因小麦型饲料类型而定，体外消化酶解法筛选合适的小麦酶很有必要。