苜蓿产量高、质量高，适用于大部分畜禽[1-3]。苜蓿茎叶富含营养活性物质，如皂苷、苜蓿酚、苜蓿素、瓜氨酸、糖等[4-6]。大型奶牛场为保持高产奶量，苜蓿干草饲喂量高达3.5 kg/(头·d)。潮湿多雨的天气，易导致苜蓿干草发霉变质、影响品质、造成损失，影响苜蓿干草的制作和饲喂。高质量的苜蓿青贮不受气候影响，可较长时间储存且保持原有的营养成分，适口性更好，更易消化[7]。因此，生产中常使用苜蓿青贮替代苜蓿干草。朱晓艳等[8]研究表明，等干物质（2 kg）的苜蓿青贮等量替代苜蓿干草可提升牛奶质量，增加经济效益。范金星等[9]研究表明，使用苜蓿青贮替代50%的苜蓿干草可增加奶牛采食量。本试验中精料与大豆皮的比例固定为40∶25，通过改变苜蓿青贮与苜蓿干草的比例，探究苜蓿青贮替代苜蓿干草对瘤胃体外发酵参数的影响，筛选出相对最佳的比例，为生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验选用的精料（C）与大豆皮（SH）、苜蓿干草（AH）、苜蓿青贮（AS）均由沧州中特牧业提供。试验前原料65 ℃烘干48 h至恒重，粉碎，过20目筛，置于干燥密封环境保存。试验原料常规营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.002.T001表1原料营养水平（干物质基础）项目CSHAHAS干物质93.3192.0494.7593.65粗蛋白质19.2010.3113.4118.65粗脂肪4.314.881.352.38粗灰分3.225.008.6016.51中性洗涤纤维10.9562.2153.3243.78酸性洗涤纤维8.4445.6942.4633.74%1.2试验设计采用单因子重复设计，B组、C组、D组、E组、F组的C、SH、AH、AS比例分别为40∶25∶30∶5、40∶25∶25∶10、40∶25∶20∶15、40∶25∶15∶20、40∶25∶10∶25、40∶25∶5∶30，A组的C、SH、AH比例为40∶25∶35；H组的C、SH、AS比例为40∶25∶35，试验共8组，每组3个重复，设3个空白组用以校正。1.3体外发酵试验取按照试验设计比例配好的0.5 g发酵底物，装入干净、干燥的纤维袋。纤维袋称重，密封后再称重，阴暗干燥的环境中保存。100 mL发酵瓶编号，放入与其对应的纤维袋。参照Menke等[10]方法，配制人工缓冲瘤胃液，39 ℃条件下CO2不断通入人工缓冲瘤胃液至褪色为止。将人工瘤胃缓冲液和荷斯坦阉牛的瘤胃液以3∶1的比例混合并搅匀，将60 mL混合瘤胃液装入发酵瓶马上密封，置于39 ℃的恒温气浴摇床，分别在发酵开始后的第2、4、8、12、24、36、48 h测其产气量，并用空白组进行对照校正。1.4测定指标及方法1.4.1产气量及产气参数根据Mauricio等[11]方法，测定各时间点（2、4、6、8、10、12、24、36和48 h）累积的产气量（GP），记录数值，代入产气量模型计算产气参数。GP=a+b(1-e-ct)(1)式中：t为发酵时间（h）；GP为t时刻的产气量（mL）；a为快速降解部分产气量（mL）；b为慢速降解部分产气量（mL）；c为产气速率常数（%/h）；a+b为潜在产气量（mL）[12]。1.4.2干物质消化率（IVDMD）体外发酵试验计时48 h，立刻取出发酵瓶，放置冰水中终止发酵，将纤维袋取出用蒸馏水冲洗干净，随即放入105 ℃的烘箱至恒重，称量发酵后纤维袋的重量。IVDMD=(发酵前底物重量－发酵后底物重量)/发酵前底物重量×100%(2)1.4.3发酵参数数发酵结束，立即使用UB-7 pH测定仪（美国）测定发酵液pH值。剩余的发酵液分别装入15 mL和10 mL的离心管，15 mL离心管内的发酵液参照冯宗慈等[13]方法测定发酵液中的NH3-N浓度，10 mL离心管内的发酵液分别参照苏海涯[14]和Erwin等[15]方法测定发酵液中微生物蛋白质（MCP）和挥发性脂肪酸（VFA）的浓度。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2016统计整理，SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1各饲料组合的产气量及参数（见表2、表3）由表2可知，随着苜蓿青贮占比的提升，各组的2 h、4 h产气量呈先升后降趋势，D组2 h产气量和4 h产气量显著高于A组、B组、F组、G组、H组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.002.T002表2各饲料组合的产气量项目GP2 hGP4 hGP8 hGP12 hGP24 hGP36 hGP48 hA组15.56b19.83c37.7454.1675.6799.41120.36B组17.76b21.48c38.2554.5477.71102.24124.14C组21.49a24.71ab39.1055.3179.42106.19130.08D组21.94a25.02a40.8257.3680.64111.54134.59E组21.64a24.71ab40.3056.5980.23107.62130.63F组17.90b22.24bc38.7655.0978.53104.82126.16G组17.46b21.34c38.0954.3576.24101.78124.11H组16.15b19.98c38.0754.3476.0599.72122.63SEM0.570.490.390.470.721.341.60P值0.000.000.450.680.540.300.37注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mL由表3可知，随着苜蓿青贮占比的提升，各组的a、b和a+b呈现先升后降趋势，D组的a、b显著高于A组、B组、F组、G组、H组（P0.05）；a+b显著高于A组、B组、C组、F组、G组、H组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.002.T003表3各饲料组合的产气参数项目a/mLb/mLc/(%/h)a+b/mLA组7.69d144.03d0.022151.72eB组11.18bc200.50bc0.019211.68cdC组13.43ab217.20ab0.018230.63bcD组15.35a229.67a0.015245.02aE组14.37a218.27ab0.016232.64abF组11.36bc206.73bc0.019218.09bcdG组10.10c198.30c0.019208.40cdH组9.60cd188.67c0.019198.27dSEM0.555.380.005.49P值0.000.000.250.002.2各饲料组合的体外发酵参数（见表4）由表4可知，D组的MCP浓度显著高于A组、H组（P0.05），NH3-N浓度显著高于A组、B组、G组、H组（P0.05）。A组的MCP浓度显著低于C组、D组、E组（P0.05），NH3-N浓度显著低于其他组（P0.05）。D组的pH值显著低于其他组（P0.05），A组pH最高，显著高于H组以外的其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.002.T004表4试验各组的体外发酵指标项目IVDMD/%NH3-N/(mg/L)MCP/(g/L)pH值A组0.7480.70c8.25c6.88aB组0.76167.20ab9.03bc6.82cC组0.78177.50ab10.73ab6.82cD组0.81223.00a11.17a6.77dE组0.80193.40ab11.07a6.80cF组0.77168.40ab9.48abc6.82cG组0.76153.60ab8.97c6.85bH组0.76146.70b8.71c6.87aSEM0.001.030.280.00P值0.260.020.000.002.3各饲料组合的VFA浓度（见表5）由表5可知，随着AS占比的改变，各组的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、异丁酸、总挥发性脂肪酸浓度先显著上升后又显著下降（P0.05）。D组的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、异丁酸、总挥发性脂肪酸浓度最高（P0.05），A组的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、异丁酸、总挥发性脂肪酸浓度最低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.002.T005表5各饲料组合的VFA浓度项目乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)丁酸/(mmol/L)戊酸/(mmol/L)异戊酸/(mmol/L)异丁酸/(mmol/L)总挥发性脂肪酸/(mmol/L)乙酸/丙酸A组44.92b12.81c5.67c1.25de1.01b0.69cd66.35b3.51B组54.06b15.32bc6.22c1.37cde1.16b0.86bcd78.99b3.53C组74.46a20.44ab9.78ab1.93b1.77a1.02bc109.40a3.64D组91.37a24.89a10.31a2.46a1.89a2.13a133.05a3.67E组86.13a24.62a9.61ab2.36a1.79a1.04b125.55a3.50F组52.10b17.23bc7.41bc1.66bc1.12b0.83bcd80.35b3.02G组51.81b14.69bc6.41c1.59bcd1.10b0.64d76.24b3.53H组45.28b12.70c5.66c1.10e0.95b0.59d66.28b3.57SEM3.991.090.451.040.091.025.730.06P值0.000.000.000.000.000.000.000.213讨论3.1苜蓿青贮替代苜蓿干草对产气量及参数的影响发酵底物的可发酵物质与反刍动物瘤胃微生物活性共同决定了瘤胃产气量[16]。酸性洗涤纤维（ADF）和中性洗涤纤维（NDF）等结构性碳水化合物含量越高，瘤胃产气量越低[17]。A组的ADF和NDF含量相比H组较高，其GP低于H组，与该研究结果一致。结构性碳水化合物相比于非结构性碳水化合物难被发酵，故结构性碳水化合物需要更多的时间发酵。研究表明，非结构性碳水化合物含量较高的饲料需要24 h达到产气高峰，而相对难以发酵的结构性碳水化合物需要48 h[18]。本试验中，各组48 h的累积产气量均未超过其潜在产气量，可能因为各组的结构性碳水化合物含量较高。随着AS比例的上升，各组的a、b以及a+b均呈先升后降趋势，B组（30% AH+5% AS）、C组（25% AH+10% AS）、D组（20% AH+15% AS）、E组（15% AH+20% AS）、F（10% AH+25% AS）、G组（5% AH+30% AS）的GP均高于A组（35% AH）和H组（35% AS），表明AS替代一定比例的AH，饲料结构有所改变，可提高饲料的可发酵性，提高GP，产生正组合效应[19]。D组（20% AH+15% AS）的GP最高，表明该比例下产生的正组合效应最大。3.2A苜蓿青贮替代苜蓿干草对发酵参数的影响IVDMD可反映动物对营养物质的吸收能力、饲料质量优劣与营养价值[20-21]。IVDMD与GP呈正相关[22]。本试验中，各组的IVDMD与GP变化趋势均呈先升后降，与该研究结果一致。pH值在正常范围内是反刍动物瘤胃环境稳定、瘤胃微生物正常活动生长的前提条件，一定程度上可反映瘤胃的发酵水平[23]。为维持反刍动物瘤胃环境的稳定，反刍动物的瘤胃液pH值应保持在6~7之间。本试验各组的pH值在6.77~6.88之间，均属于正常值，利于瘤胃微生物的生长。反刍动物瘤胃中的微生物将瘤胃液中的粗蛋白等各种含氮化合物转化为NH3-N[24]。瘤胃液中NH3-N的浓度对于维持反刍动物正常生长生产至关重要，过高或过低的NH3-N浓度均影响瘤胃微生物合成MCP的效率，导致动物出现生产能力低下等各种问题[25]。Calsamiglia等[26]指出，反刍动物瘤胃液中NH3-N浓度在63~275 mg/L之间较为合适。本试验中，各组的NH3-N浓度在80.70~223.00 mg/L之间，与该研究结果一致。MCP由NH3-N在瘤胃微生物的作用下转化，MCP反映瘤胃液中瘤胃微生物转化分解含氮物质的能力，瘤胃微生物转化NH3-N的能力越强，MCP的浓度越高[27]。瘤胃中产生的MCP也是反刍动物的重要氮源，反刍动物小肠吸收的蛋白几乎来自MCP[28]。本试验中，随着AS比例的升高，NH3-N浓度与MCP浓度变化趋势一致。D组（20% AH+15% AS）的NH3-N浓度与MCP浓度最高，表明在该组合比例下瘤胃微生物活性与发酵底物的可发酵性有所升高，产生的正组合效应最大。瘤胃中的VFA是维持反刍动物生长的重要能量来源，可反映发酵底物在瘤胃中发酵情况。反刍动物体内碳代谢过程中约66%的碳来自VFA，是反刍动物生命活动重要的碳源，也是反刍动物生成体脂的原料之一[29-30]。研究表明，反刍动物的IVDMD越高，产生的VFA浓度越高，瘤胃液的pH降低[31-32]。本试验中，D组（20% AH+15% AS）的VFA含量最高，表明以15%的AS替代等干物质量的AH可提高瘤胃中发酵底物的利用率。4结论本试验条件下，20% AH+15% AS组合的瘤胃发酵效果相对最佳，C∶SH∶AH∶AS为40∶25∶20∶15。