刺五加多糖（ASPS）是从五加科五加属植物刺五加的根茎中提取的一种多糖，可以消除自由基，具有抗衰老的功效。刺五加多糖中含有动物机体所需的微量元素及氨基酸，可以提高动物机体的免疫力[1]。目前，预防和控制禽流感的主要方法依然是接种禽流感疫苗，传统的灭活疫苗存在免疫力持续时间短的问题，减毒活疫苗可能出现“毒力返祖”的现象，DNA疫苗可能整合到免疫动物的染色体造成动物免疫应激反应大[2]。同时，ASPS也存在着与禽流感疫苗抗原结合吸附性差，机体代谢快以及部分减溶性多糖不易吸收的缺点[3]。纳米粒（nanoparticle，NP）可作为药物靶向传递载体，具有较强的细胞穿透和靶向能力以及良好的生物相容性，NP已成为一种很有前途的新型药物制剂[4]。聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）是带有大量正电基团的水溶性阳离子聚合物，其作为理想生物大分子载体能够与带负电的生物大分子产生较强静电作用力，同时PEI具有较强的亲水性，可以形成水性微环境，有利于维持生物大分子的活性[5]。利用PEI带有大量正电基团与刺五加多糖纳米粒表面的负电基团产生静电作用力，为疫苗抗原提供靶向作用，保证药物效应的前提下降低给药剂量，从而显著提高药物的生物利用度[6]。本试验通过检测雏鸡体内免疫器官指数、H5N1抗体水平、雏鸡血清中细胞因子表达量的变化，研究PEI修饰的刺五加多糖纳米粒作为免疫佐剂增强禽流感疫苗的免疫效果，为临床上提供一种有效的疫苗免疫佐剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物1日龄健康三黄鸡（公、母各半）由许昌市某鸡场提供，常规饲养至14 d开始试验。1.1.2主要药品、试剂及设备碳酸钠（Na2CO3）、氯化钙（CaCl2）均购自天津市致远化学试剂有限公司；聚乙烯亚胺（PEI）购自上海易恩化学技术有限公司；刺五加多糖（纯度98%）、黄芪多糖（纯度98%）均购自西安小草生物科技有限公司；H5N1亚型禽流感灭活苗购自哈药集团生物疫苗有限公司；鸡的白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）、干扰素-γ（IFN-γ）ELISA试剂盒均购自上海朗顿生物有限公司；鸡的AIV-H5-Ab ELISA试剂盒购自睿信生物科技有限公司。LUX酶标仪、424R离心机均购自德国艾本德公司；SPX-25OBSH-Ⅱ生化培养箱购自上海新苗医疗器械制造有限公司；BSA224S电子天平购自赛多利斯公司；371型CO2培养箱购自美国Thermo公司；ms-h280数显加热磁力搅拌器购自北京大龙兴创实验仪器有限公司。1.2试验方法1.2.1药物的制备根据前期实验室优化条件，将Na2CO3水溶液注入等量的CaCl2中以制备CaCO3纳米粒；将CaCl2（0.5 mol/L）与ASPS（0.2 mol/L）混合溶液以中等速率搅拌30 min，加入0.5 mol/L Na2CO3溶液。将用于反应的混合溶液在500 r/min和40 ℃下搅拌5 min，离心收集产物，重悬制备CaCO3-ASPS纳米粒；取CaCO3-ASPS纳米粒5 mL加入PEI（1%），混合搅拌30 min，制备成CaCO3-ASPS-PEI纳米粒。1.2.2试验设计选取1日龄健康三黄鸡150只（公、母各半），随机分为6组，每组5个重复，每个重复5只鸡。空白组（0.6 mL生理盐水）、阳性组（10 g/L ASPS，0.3 mL）、单独疫苗组、CaCO3组、CaCO3-ASPS组（10 g/L ASPS，0.3 mL）、CaCO3-ASPS-PEI组（10 g/L ASPS，0.3 mL）。除空白组外，其余组均在14 d进行首免，注射上述各自药物，注射H5N1亚型禽流感灭活苗0.3 mL，在21、28 d进行二免和三免。1.3测定指标及方法1.3.1免疫器官指数分别在第21、28、35 d从各组随机抽取雏鸡，屠宰前记录空腹体重。屠宰过程中记录免疫器官（脾脏、胸腺、法氏囊）重量，计算免疫器官指数[7]。脏器指数=器官重量/体重(1)1.3.2H5N1抗体水平分别在第21、28、35 d采集各组鸡血清，室温静置1 h，3 000 r/min离心15 min。抗体检测方法按照AIV-H5-Ab Elisa试剂盒说明书进行[8]。1.3.3血清中细胞因子表达量分别在第21、28、35 d采集各组鸡血清，采用ELISA试剂盒测定雏鸡血清中IL-2、IL-4、IFN-γ细胞因子表达量，具体检测方法按照试剂盒操作说明书[9]进行。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，Tukey法多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡免疫器官指数的影响（见表1）由表1可知，与空白组相比，28 d时阳性对照组三黄鸡胸腺指数显著升高（P0.05），35 d胸腺和脾脏指数显著升高（P0.05）；35 d时CaCO3-ASPS-PEI组三黄鸡的胸腺、脾脏和法氏囊指数显著升高（P0.05）。与单独疫苗组相比，35 d时阳性组三黄鸡的胸腺和脾脏指数显著升高，28 d时法氏囊指数显著升高（P0.05）；28、35 d时CaCO3-ASPS-PEI组三黄鸡的脾脏和法氏囊指数显著升高（P0.05），35 d时胸腺指数显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.012.T001表1PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡免疫器官指数的影响日龄组别脏器指数胸腺指数脾脏指数法氏囊指数21 dCaCO3组0.22±0.000.10±0.020.18±0.02▲#CaCO3-ASPS组0.22±0.030.16±0.01#0.12±0.03CaCO3-ASPS-PEI组0.25±0.04#0.11±0.020.21±0.03▲#单独疫苗组0.24±0.040.11±0.010.10±0.01空白组0.21±0.020.10±0.000.11±0.01阳性对照组0.27±0.03#0.10±0.010.17±0.03▲#28 dCaCO3组0.21±0.040.10±0.030.14±0.03CaCO3-ASPS组0.29±0.03#0.10±0.030.12±0.01CaCO3-ASPS-PEI组0.27±0.020.15±0.03▲#0.20±0.03▲#单独疫苗组0.24±0.060.11±0.000.15±0.00空白组0.23±0.020.10±0.030.11±0.03阳性对照组0.30±0.10#0.11±0.020.20±0.02▲35 dCaCO3组0.35±0.030.14±0.010.19±0.01CaCO3-ASPS组0.35±0.050.14±0.010.19±0.02CaCO3-ASPS-PEI组0.39±0.01▲#0.15±0.01▲#0.22±0.02▲#单独疫苗组0.33±0.040.11±0.020.16±0.01空白组0.30±0.010.10±0.020.17±0.02阳性对照组0.38±0.00▲#0.15±0.02▲#0.18±0.03注：与空白组相比，“#”表示差异显著（P0.05），“##”表示差异极显著（P0.01）；与单独疫苗组相比，“▲”表示差异显著（P0.05），“▲▲”表示差异极显著（P0.01）；表3~6与此同。2.2PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡H5N1抗体水平的影响（见表2）由表2可知，CaCO3-ASPS组、CaCO3-ASPS-PEI组、阳性对照组在第21 d的H5N1合格率为60%；除空白组外，其他组在第28、35 d样品H5N1合格率为100%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.012.T002表2PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡H5N1抗体水平的影响日龄组别OD值判定合格率阴性对照组0.067 0-阳性对照组0.327 0+21 dCaCO3组0.308 7-55%CaCO3-ASPS组0.332 1+60%CaCO3-ASPS-PEI组0.331 8+60%单独疫苗组0.303 3-57%空白组0.158 9-0阳性对照组0.328 5+60%28 dCaCO3组0.380 5+100%CaCO3-ASPS组0.397 0+100%CaCO3-ASPS-PEI组0.372 2+100%单独疫苗组0.356 8+100%空白组0.210 9-0阳性对照组0.417 6+100%35 dCaCO3组0.424 9+100%CaCO3-ASPS组0.428 6+100%CaCO3-ASPS-PEI组0.431 2+100%单独疫苗组0.423 5+100%空白组0.199 4-0阳性对照组0.459 1+100%注：“+”表示合格，“-”表示不合格。2.3PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡血清中细胞因子表达量影响（见表3~表6）由表3可知，与空白组相比，28 d时CaCO3-ASPS-PEI组三黄鸡血清IL-2表达量显著提高（P0.05），35 d时IL-2表达量极显著提高（P0.01），28、35 d时阳性对照组IL-2表达量极显著提高（P0.01）。与单独疫苗组相比，28 d时CaCO3-ASPS-PEI组三黄鸡血清IL-2表达量显著提高（P0.05），35 d时IL-2表达量极显著提高（P0.01），28、35 d时阳性对照组IL-2表达量极显著提高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.012.T003表3PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡血清中IL-2表达量的影响组别21 d28 d35 dCaCO3组53.955±3.22354.785±3.66159.865±3.118CaCO3-ASPS组52.916±12.30559.161±6.60969.684±4.155##CaCO3-ASPS-PEI组51.263±3.26670.981±9.479▲#72.590±1.422▲▲##单独疫苗组48.851±1.51652.727±4.74349.585±4.732空白组41.423±6.03442.592±2.16848.381±5.678阳性对照组51.025±2.76281.858±3.535▲▲##85.675±3.247▲▲##由表4可知，与空白组相比，21、35 d时CaCO3-ASPS-PEI组三黄鸡血清IL-4表达量显著提高（P0.05），28 d时极显著提高（P0.01）。与单独疫苗组相比，21、28、35 d时CaCO3-ASPS-PEI组血清IL-4表达量显著提高（P0.05），21、35 d时阳性对照组血清IL-4表达量显著提高（P0.05），28 d时极显著提高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.012.T004表4PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡血清中IL-5表达量的影响组别21d28 d35 dCaCO3组109.501±4.969129.362±1.160120.212±6.053CaCO3-ASPS组130.919±7.292140.992±5.036145.054±7.412#CaCO3-ASPS-PEI组163.069±6.752▲#186.365±7.229▲##177.484±4.925▲#单独疫苗组109.583±1.239126.868±3.273116.383±6.895空白组108.672±3.972112.205±9.23092.012±8.960阳性对照组177.166±10.485▲#224.192±5.338▲▲##181.345±8.881▲##由表5可知，与空白组相比，21、28、35 d时CaCO3-ASPS-PEI组三黄鸡血清IL-6表达量均极显著提高（P0.01）。与单独疫苗组相比，21、35 d时CaCO3-ASPS-PEI组血清IL-6表达量均显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.012.T005表5PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡血清中IL-6表达量的影响组别21 d28 d35 dCaCO3组96.930±0.353117.967±2.915140.468±4.814CaCO3-ASPS组107.961±0.230189.074±0.049##158.860±3.489#CaCO3-ASPS-PEI组159.493±1.828▲##200.725±1.933▲##167.893±5.321▲##单独疫苗组130.673±4.926172.519±1.109144.027±0.762空白组63.220±0.640156.268±0.139293.920±2.550阳性对照组158.814±11.787▲##181.107±0.045##163.858±1.951▲##由表6可知，与空白组相比，28、35 d时CaCO3-ASPS-PEI组三黄鸡血清IFN-γ表达量均极显著提高（P0.01）。与单独疫苗组相比，CaCO3-ASPS-PEI组血清IFN-γ表达量均极显著提高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.012.T006表6PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡血清中IFN-γ表达量的影响组别21 d28 d35 dCaCO3组152.956±7.715156.411±5.587190.637±11.165CaCO3-ASPS组165.302±2.706139.639±10.142167.670±26.706CaCO3-ASPS-PEI组166.545±2.933223.778±4.047▲▲##243.109±5.152▲▲##单独疫苗组153.179±7.811153.014±3.232149.376±1.577空白组149.265±3.175149.700±3.355148.596±5.252阳性组182.542±0.556▲#209.582±4.530▲▲##254.661±9.778▲▲##3讨论禽流感疫苗接种依然是目前预防和控制禽流感的重要方法。目前，寻找一种生物利用度更高、免疫原性更好且适用范围广的新型佐剂与传统禽流感疫苗配合，帮助养禽业摆脱禽流感疫情困境具有重要意义。3.1PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡免疫器官指数的影响胸腺、脾脏和法氏囊是雏鸡重要的免疫器官[10]，器官指数水平决定其淋巴细胞的增殖，可以在某种程度上反映雏鸡机体免疫功能的状况[11-12]。本试验检测雏鸡21、28、35 d的脏器指数，结果发现，与空白组相比，阳性对照组三黄鸡胸腺指数随日龄增长呈上升趋势，在35 d时显著；脾脏提高、法氏囊指数在21 d、28 d时显著提高，说明疫苗免疫引起免疫器官重量显著增加；与单独疫苗组相比，CaCO3-ASPS-PEI组于28、35 d时脾脏指数和法氏囊指数显著提高，说明PEI修饰的碳酸钙纳米乳能够显著增加雏鸡的脏器指数。3.2PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡H5N1抗体水平的影响雏鸡血清中的AIV-H5-Ab水平是检测禽流感疫苗免疫效果的重要指标。本试验采用间接酶联免疫吸附试验方法对雏鸡H5N1抗体水平进行检测[13]。本试验研究发现，CaCO3-ASPS组、CaCO3-ASPS-PEI组、阳性对照组在第21 d时H5N1的合格率为60%；除空白组外，其他组在第28、35 d样品H5N1均合格，合格率为100%，说明雏鸡在第28 d禽流感抗体水平达到较高水平，PEI-ASPS-CaCO3组对禽流感疫苗的保护力增强。3.3PEI修饰的碳酸钙-刺五加多糖纳米粒与禽流感疫苗配合对雏鸡脾淋巴细胞因子表达量的影响淋巴细胞是适应性免疫应答中的关键部分，由免疫细胞（单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞等）经刺激而合成、分泌的一类小分子蛋白质，一般通过结合相应受体调节细胞的生长和分化以及调控细胞的免疫应答[14]。细胞因子IL-2作为T细胞生长因子可以激活并促进T细胞的生长[15]。细胞因子IL-4是由活化T细胞产生的生长因子，其对B细胞、肥大细胞、巨噬细胞甚至是T细胞本身均有一定免疫调节作用[16]。细胞因子IL-6是由活化T细胞、成纤维细胞两种细胞生成，同时IL-6可以与集落刺激因子互相协同，共同增强NK细胞的裂解功能。细胞因子IFN-γ本身可以产生多种细胞反应，主要功能是促进抗原呈递速度，提高巨噬细胞溶酶体的活性[17]。本试验采用ELISA试剂盒检测21、28、35 d时雏鸡血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ的表达量，结果表明，与空白组和单独疫苗组相比，CaCO3-ASPS-PEI组三黄鸡各细胞因子呈现不同的变化趋势。细胞因子IL-2、IFN-γ表达增长较晚，在第35 d时表达量分别为72.590、243.109 ng/L，细胞因子IL-4、IL-6在第28 d时表达量分别为186.365、200.725 ng/L。4结论CaCO3-ASPS-PEI与H5N1亚型禽流感疫苗结合可显著提高雏鸡免疫器官指数，提高禽流感抗体水平，增强雏鸡血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 四种细胞因子的表达量，可以作为一种有效的免疫佐剂与疫苗配合使用，增强疫苗的免疫效果。