猫细小病毒（feline parvovirus，FPV）又称猫瘟病毒，属于细小病毒科（Parvoviridae），是引起猫科动物病毒性腹泻的常见病原体之一[1]。感染FPV后，患猫表现为高热、乏力、厌食、呕吐、急性腹泻和出血性肠炎等症状，白细胞数目大量减少，具有高发病率和高病死率[2]。猫细小病毒能够通过患猫的粪便排泄物、呕吐物和眼鼻分泌物等排出体外，也可通过体外寄生虫传播[3]。1928年，法国科学家首次发现FPV，后来又从猫、猴子、浣熊等多种动物身上成功分离出该病毒[4-6]。猫细小病毒蛋白（VP）基因易发生重组变异[7]。近年来，随着病毒与宿主的共同进化，FPV出现变异现象。有研究利用宏基因组学对病毒进行分析，发现了新的细小病毒，导致细小病毒科的分类发生变化。根据国际病毒分类委员会（ICTV）的分类标准，细小病毒科目前被分为3个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科（Parvovirinae）、感染无脊椎动物的浓核病毒亚科（Densovirinae）以及同时感染两种动物的新亚科（Hamaparvovirinae）[8-11]。其中，属于细小病毒亚科（Parvovirinae）的FPV、浓核病毒亚科（Densovirinae）的博卡病毒（FBoV）和新亚科（Hamaparvovirinae）的（Fechavirus）均可引起猫腹泻和肠道感染，能够与其他肠道病毒联合感染导致更严重的临床症状，如出血性肠炎[12-13]。FPV、FBoV和Fechavirus混合感染在腹泻猫中也很常见。由于3种病毒具有相似的临床症状和合并感染概率，在临床诊断和流行病学调查中很难区分。为进一步了解FPV的变异情况，本研究从各地收集猫病料粪便样本，经FPV抗原检测试纸和PCR检测双重验证，测序并分析其序列遗传进化情况，了解该变异株的分类地位，为后续对猫细小病毒鉴定和防控提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样本来源猫粪便样本采集于各地宠物医院和诊所，采用棉签在猫的肛门采集病料，样本进行编号，低温保存和运输。1.1.2试剂与仪器主要试剂：FPV抗原检测试纸（杭州奥泰生物技术股份有限公司）；核酸提取试纯化剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；Buffer、酶、50×TAE、DL 2000、Loading Buffer、GenRed（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；琼脂糖（GENERAY）；氯化钠（Solarbio）。主要仪器：高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；电泳仪电源、水平电泳槽（北京六一生物科技有限公司）；紫外透射切胶台（北京六一生物科技有限公司）；微波炉（广东美的厨房电器制造有限公司）；旋涡混合器（太仓市华利达实验设备有限公司）；Real-Time PCR（Thermo Fisher Scientific）。1.1.3引物信息引物信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.009.T001表1引物序列信息Tab.1Primer sequence information引物序列（5'→3'）片段长度/bpFPV-FCATACATGGCAAACAAATAGAGCA237FPV-RTGTTTTAAATGGCCCTTGTGTAGAFBoV-FAGAACCRCCRATCACARTCCACT465FBoV-RTGGCRACCGCYAGCATTTCAFechavirus-F1GGTGCGACGACGGAAGATAT332Fechavirus-R1CAACACCACCATCTCCTGCTFechavirus-F2GCTGCAGTTCAGGTAGCTCA3101.2试验方法1.2.1FPV抗原试纸检测采用FPV抗原检测试纸，将猫粪便样本（1Q~15Q）分别与缓冲液搅拌混匀，确保充分提取样品。将测试板放置于平整干净的桌面，取3滴样品（约120 μL）垂直加入测试板上的样品孔中，开始计时；5 min后判读结果，10 min后结果无效。1.2.2病毒核酸提取取适量粪便样本，分别装入1.5 mL的离心管，加入500 μL 0.9%生理盐水，充分振荡混匀，12 000 r/min离心2 min，取200 μL上清液于新离心管。根据核酸提取纯化试剂盒说明书进行操作，将提取的核酸置于-20 ℃保存。1.2.3PCR扩增采用FPV、FBoV和Fechavirus引物对样本DNA进行PCR扩增，所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反应体系（25 μL）：Buffer 5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、模板5 μL、酶2 μL、ddH2O 11 μL。FPV-F/R反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。FBoV-F/R反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。FechavirusF1/R1和F2/R1反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。1.2.4琼脂糖凝胶电泳检测及测序取5 µL扩增产物混合Loading Buffer后加入1%琼脂糖凝胶，在1×TAE缓冲液中进行电泳检测，电泳条件为电压180 V，时间30 min。在紫外透射仪中观察结果，以DNA Marker DL2000为分子量标准，观察记录条带位置和试验数据，并保存电泳图片。将正确扩增的产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。1.2.5数据统计与分析根据Genbank中已公开的猫细小病毒序列信息，将所有序列经Blast比对，采用BioEdit软件将序列全部调整为5'→3'。利用MEGA 7.0软件，采用最大似然法（maximum likelihood algorithm，ML）同NCBI中下载的序列构建进化树；采用Kimura2-parameter碱基替换模型，对所有对位排列结果中产生的空位（gaps）或缺失数据（missing data）选择完全删除（complete deletion）；进化树每个分支的支持率采用bootstrap方法计算，设定5 000次重复[14]。若每个种的所有个体均聚为1个单系分支，则认为该物种鉴定正确[15]。2结果与分析2.1FPV抗原试纸检测结果（见表2）利用FPV抗原检测试纸，加样后5 min进行结果判读。由表2可知，1Q~14Q为阴性，15Q为阳性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.009.T002表2FPV测试结果Tab.2FPV test result编号结果编号结果FPV-1Q-FPV-2Q-FPV-3Q-FPV-4Q-FPV-5Q-FPV-6Q-FPV-7Q-FPV-8Q-FPV-9Q-FPV-10Q-FPV-11Q-FPV-12Q-FPV-13Q-FPV-14Q-FPV-15Q+注 ：+为阳性，-为阴性。2.2分子检测鉴定2.2.1电泳检测结果（见图1））分别采用FPV-F/R、FBoV-F/R、Fechavirus-F1/R1和Fechavirus-F2/R1引物对猫核酸样本（1Q~15Q）进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。其中，FPV片段大小约为237 bp，FBoV片段大小约为465 bp，Fechavirus-F1/R1片段大小约为332 bp，Fechavirus-F2/R1片段大小约为310 bp。将扩增长度正确的PCR产物进行基因测序。由图1可知，FPV-14Q和FPV-15Q在FPV-F/R引物的扩增下获得了237 bp左右的条带，FPV-5Q在Fechavirus-F1/R1引物的扩增下获得了332 bp左右的条带，符合目标片段位置。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.009.F001图1电泳检测结果Fig.1Partial electrophoresis result注 ： M为DNA分子量标准（DL2000）；FPV-5Q为猫核酸样本。因此，推测FPV-14Q和FPV-15Q为常规的猫细小病毒样本，FPV-5Q为变异猫瘟Fechavirus样本。2.2.2序列比对结果（见图2）为进一步验证FPV-5Q的胶体金层析和电泳检测结果，将PCR产物送至华大基因公司测序。根据测序结果，利用Chorme软件观察峰图是否存在套峰，并将合格的序列进行Blast和DNAMAN比对。由图2可知，FPV-5Q与NCBI中MN396757.1（Fechavirus）的序列同源性达到100%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.009.F002图2序列比对结果Fig.2Sequence alignment result2.2.3ML进化树（见图3）为更加直观准确地鉴定FPV-5Q样本，基于FPV-5Q的Fechavirus-F1/R1片段构建进化树，以猫星状病毒（FeAstV）为外群，同Genbank中公布的序列（猫细小家族的FPV、FBoV和FeBuV），利用最大似然法构建进化树。由图3可知，FPV和FeBuV聚为同一分支，二者亲缘关系更近，FboV和Fechavirus聚为同一支，获得较高的自展支持率。其中，FPV-5Q与两个Fechavirus在同一单系分支上，且置信度高达99%。因此，确定FPV-5Q样本中存在变异猫瘟Fechavirus。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.009.F003图3ML进化树Fig.3ML evolutionary tree3讨论猫瘟是危害猫科动物的主要病毒性疾病之一。幼猫对该病极易感，且发病急、传播快、病死率高，猫瘟对猫科动物的健康养殖和繁育具有极大的威胁[16]。FPV在世界各地区广泛分布流行，且由于病毒在不断进化，FPV出现变异。有研究陆续在猫身上发现新的细小病毒种类。因此，加强FPV流行状况及遗传进化的分析，对减少该病的发生与流行具有重要的意义[17]。与PCR检测技术相比，胶体金检测技术的应用更方便快捷，且应用广泛。但PCR技术的敏感性远高于胶体金检测[4]。目前，在猫细小病毒病临床诊断中仍以胶体金作为主要检测方法。若猫正处于感染的潜伏期或是感染变异细小病毒，在检测过程中可能存在假阴性，而PCR均能够有效检测。因此,在临床诊断中，若出现疑似FPV感染且胶体金检测结果为阴性时，建议采取PCR检测进一步验证，以此确定是否患病动物感染变异细小病毒。本研究对收集的猫粪便疑似样本进行FPV抗原检测试纸检测和PCR扩增检测，FPV-5Q在试纸检测中呈阴性结果，而在Fechavirus-F1/R1引物的PCR扩增中呈阳性，且与NCBI中MN396757.1（Fechavirus）的序列进行比对，二者同源性达到100%。以FeAstV为外群，利用最大似然法构建猫细小家族进化树，FPV和FeBuV聚为同一分支，推测二者亲缘关系更近，FBoV和Fechavirus聚为同一支，获得较高的自展支持率。而FPV-5Q与两个Fechavirus在同一单系分支上，遗传距离更近，且置信度高达99%，确定FPV-5Q样本中存在变异猫瘟Fechavirus。目前尚无治疗FPV的特效药物，疫苗接种是唯一有效的防控措施。但对于新出现的猫细小病毒,也暂无有效疫苗可用[18]。新型细小病毒的出现给疫苗免疫工作带来一定挑战，医护人员在猫胃肠道疾病的诊断工作中需要考虑到新病毒的存在，包括Fechavirus、FBoV等[19]。为尽可能地限制病毒的传播，应及时采取消毒和物理隔离等防控措施，在空间传播上做到有力管控。因此，研制开发新型、快速、安全、高效的抗FPV的疫苗具有广泛的应用前景[20]。本研究对猫细小病毒变异株Fechavirus进行了验证，为及早预防和治疗FPV感染以及研制适合我国猫科动物的细小病毒变异疫苗株提供参考。4结论本试验利用FPV抗原试纸和PCR双重验证，证明我国感染猫科动物宿主的新型细小病毒Fechavirus的存在，且PCR技术在鉴别新型细小病毒的研究中具有更高的特异性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.009.F004