仔猪腹泻是仔猪常发生的疾病之一，表现为呕吐、腹泻、严重脱水。不同生长周期的猪均会感染腹泻，但仔猪腹泻发病率更高[1]。腹泻威胁着幼龄动物的健康，也导致畜牧业出现经济损失[2]。仔猪腹泻一般分为非病原性腹泻和病原性腹泻。非病原性腹泻多数是由饲喂不当或应激反应所致。病原性腹泻又分为细菌性腹泻、病毒性腹泻和寄生虫性腹泻，其中细菌性腹泻为主要原因。产肠毒素大肠杆菌是导致细菌性腹泻的主要细菌[3]，产肠毒素大肠杆菌进入小肠时通过菌毛或表面定植剂附着在肠上皮细胞上，并在小肠细胞表面定植[4]。大肠杆菌成功附着和定植后释放肠毒素，肠毒素是其毒力的主要因素[5]。仔猪未断奶时可以从母乳中获取抗体，不会致病。仔猪断奶后由于消化功能不完善且无法从母乳中获取抗体，极易感染大肠杆菌性腹泻[6]。传统养殖场治疗仔猪腹泻常使用抗生素，但过于依赖抗生素，不仅会增强细菌的耐药性，而且也导致药物残留，危害健康。中草药因具有天然性、多功能性、无残留、绿色环保等优势成为近年来研究替代抗生素的热点[7]。苍术为菊科植物茅苍术（Atractylodes lancea）或北苍术Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根茎，具有祛除湿邪、益气健脾、祛风散寒等功效。目前，关于苍术的资源、化学成分和药理作用等方面的研究较多[8-11]。但苍术治疗仔猪腹泻的有效活性成分及其作用机制的尚不清楚。本文通过网络药理学及分子对接技术，研究苍术治疗仔猪腹泻的有效活性成分及作用靶点，揭示作用机理，为苍术治疗仔猪腹泻提供参考。1材料与方法1.1数据库及软件TCMSP数据库（https://tcmsp-e.com/）；GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）；STRING在线网站（https://string-db.org/）；Venny在线网站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；Cytoscape3.8.0软件；微生信在线作图网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）；RCSB PDB数据库；Python 2.5软件；OpenBabel软件；AutoDock软件；AutoDockTools 1.5.7软件等。1.2试验方法1.2.1筛选苍术活性成分中药系统药理学数据库与仪器分析平台（TCMSP数据库）中查询“苍术”，按照口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18筛选苍术活性成分。1.2.2搜集苍术活性成分作用靶点通过TCMSP数据库的成分信息，搜集苍术活性成分对应靶点。利用Uniprot数据库将活性成分对应的靶点标准化为基因名称，保存为Excel表格。1.2.3获取苍术治疗仔猪腹泻靶点在GeneCards数据库中检索关键词“piglet diarrhea”，查询仔猪腹泻相关靶点，下载Excel格式搜索结果，去除重复靶点，得到仔猪腹泻靶点。将苍术活性成分作用靶点与仔猪腹泻靶点用在线网站Venny 2.1.0作韦恩图取交集，得到苍术治疗仔猪腹泻的关键靶点基因。1.2.4构建苍术活性成分作用靶点与仔猪腹泻靶点间PPI网络将苍术治疗仔猪腹泻的关键靶点导入STRING在线网络，选择物种为“Sus Scrofa”，建立苍术靶点蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，将数据结果上传至Cytoscape 3.8.0软件分析度值、中介中心性、接近中心性，筛选网络中核心靶点基因。靶点度值越大，代表该靶点与其他靶点联系越多，说明此靶点发挥重要作用的可能性很大。中介中心性和接近中心性可以描述一个靶点与其他靶点的连接情况，值越高，代表该靶点在靶点网络中越靠近中心位置，与其他靶点关系越密切。1.2.5药物-成分-靶点网络构建将苍术、苍术活性成分和苍术治疗仔猪腹泻的靶点导入Cytoscape 3.8.0软件构建药物-成分-靶点网络，共2个化合物和23个靶点，其中汉黄芩素作用的靶点18个，3β-乙酰氧基苍术酮作用的靶点7个，活性成分之间2个重合靶点。1.2.6GO和KEGG富集分析将取交集得到的潜在作用靶点导入DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，以“Sus scrofa”为物种进行分析，获得的数据利用微生信在线作图网站绘制GO柱状图和KEGG信号通路气泡图。分别得到参与生物过程55个条目、细胞组分7个条目、分子功能13个条目和KEGG信号通路50条。GO富集结果按照P值升序排序，GO-BP、GO-CC、DO-MF分别取前5个条目可视化。KEGG通路分析按照P值升序排序后取前15个通路可视化。1.2.7汉黄芩素-核心靶点分子对接在TCMSP数据库检索关键成分汉黄芩素“wogonin”，下载mol2格式文件。在RCSB PDB数据库检索核心靶点CASP3、IL-6、MAPK14、TNF，下载pdb格式文件。使用Auto Dock Tools软件对靶点大分子进行去水、加氢等操作，设为受体并保存为pdbqt格式文件；对关键活性成分小分子进行加氢操作，选为受体并pdbqt格式文件。设置对接次数为50次，对大分子和小分子进行对接，使用Pymol软件将对接结果可视化分析。2结果与分析2.1苍术活性成分的筛选利用TCMSP数据库检索得到苍术化学成分49个，经OB≥30%和DL≥0.18筛选得到苍术的有效成分9个，去除无靶点化合物得到4个化合物，苍术活性成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.T001表1苍术活性成分分子代号活性成分OB/%DLMOL000085β-胡萝卜素（beta-daucosterol_qt）36.910.75MOL000173汉黄芩素（wogonin）30.680.23MOL000184豆甾醇（Stigmastenone）39.250.76MOL0001883β-乙酰氧基苍术酮（3β-acetoxyatractylone）40.570.22由表1可知，汇总4个化合物的作用靶点，经过Uniprot数据库标准化，得到靶点的Gene symbol。去重汇总，获得苍术活性成分作用靶点59个，苍术活性成分与对应靶点见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.T002表2苍术活性成分对应靶点活性成分靶点beta-daucosterol_qtPGRwogoninBBC3、ADRB2、AHSA1、AKT1、AR、BAX、BCL2、CALM1、CASP3、CASP9、CCL2、CCND1、CDK2、CDKN1A、CHEK1、CXCL8、DPP4、EIF6、ESR1、FN1、GABRA1、GSK3B、HSP90AA1、IL-6、JUN、KDR、MAPK14、MCL1、MMP1、NOS2、PDE3A、PIK3CG、PPARG、PRKACA、PRKCD、PRSS1、PTGER3、PTGS1、PTGS2、RELA、RXRA、SCN5A、TEP1、TNF、TP53StigmastenonePGR3β-acetoxyatractyloneACHE、ADRA1A、ADRB 2、AR、CHRM 1、CHRM 2、CHRM 3、DPP 4、DRD 1、F 2、GABRA 1、HTR 2A、NOS 3、OPRM 1、PDE 3A、PTGS 2、RXRA、SCN 5A、SLC 6A 2、SLC 6A 3、SLC 6A 42.2获取苍术治疗仔猪腹泻靶点结果（见图1、表3）由图1可知，在GeneCards数据库检索“piglet diarrhea”得到仔猪腹泻靶点298个。将苍术活性成分作用靶点与仔猪腹泻靶点经Venny 2.1.0映射得到23个苍术潜在作用靶点。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.F001图1苍术活性成分靶点与仔猪腹泻靶点韦恩图由表3可知，3β-乙酰氧基苍术酮对应的仔猪腹泻靶点有7个，占总交集靶点的30.43%；汉黄芩素对应的仔猪腹泻靶点有18个，占总交集靶点的78.26%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.T003表3苍术活性成分靶点对应仔猪腹泻靶点活性成分靶点wogoninBAX、BCL2、CASP3、CASP9、CCL2、CCND1、CXCL8、DPP4、ESR1、HSP90、AA1、IL6、KDR、MAPK14、NOS2、PTGER3、PTGS1、PTGS2、TNF3β-acetoxyatractyloneACHE、DPP4、HTR2A、NOS3、OPRM1、PTGS2、SLC6A42.3苍术活性成分作用靶点与仔猪腹泻靶点间PPI网络（见图2、表4）将苍术潜在作用靶点导入STRING数据库，做蛋白互作网络图，数据结果上传Cytoscape 3.8.0软件进行分析，得到蛋白互作网络图。由图2可知，蛋白互作图包括22个节点，71条边，其中度值（Degree）≥5的靶点14个，为核心靶点。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.F002图2苍术活性成分仔猪腹泻靶点间PPI网络由表4可知，从蛋白互作图中可以得出，degree值较大的靶点有半胱氨酸蛋白酶（CASP3）、肿瘤坏死因子（TNF）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、白细胞介素-6（IL-6）。推测这几个基因在苍术治疗仔猪腹泻中起关键作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.T004表4苍术活性成分作用靶点靶点度值中介中心性接近中心性CASP3150.233 20.636 4TNF130.193 80.600 0MAPK14120.067 80.525 0IL-6120.088 30.583 3CCND190.016 30.488 4NOS290.007 80.488 4NOS390.007 80.488 4ESR180.003 40.477 3CASP970.009 50.466 7HSP90AA170.002 70.456 5KDR70.003 40.466 7PTGS160.332 50.538 5CCL260.011 90.500 0BCL250.001 20.437 52.4药物-成分-靶点网络构建（见图3）将苍术及活性成分汉黄芩素、3β-乙酰氧基苍术酮与相应的23个潜在治疗仔猪腹泻靶点导入Cytoscape 3.8.0软件，构建药物-成分-靶点网络图。由图3可知，该网络图包含26个节点，27条边，在两个活性成分中，汉黄芩素作用靶点18个，3β-乙酰氧基苍术酮作用的靶点7个，汉黄芩素作用靶点较多，表示汉黄芩素可能是苍术治疗仔猪腹泻的关键活性成分。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.F003图3药物-成分-靶点网络紫色代表苍术，黄色代表活性成分，绿色代表活性成分作用靶点。2.5GO富集分析和KEGG通路分析（见图4、图5）利用David数据库将获得的23个苍术治疗仔猪腹泻潜在靶点进行GO和KEGG信号通路富集分析。GO富集分析得到生物过程（biological process，BP）55条、细胞组分（cellular component，CC）7条和分子功能（molecular function，MF）13条。KEGG信号通路分析得到50条信号通路。GO富集分析以P0.05为条件，分别筛选BP、CC、MF中Top5的条目。由图4可知，GO-BP主要包括脂多糖介导的信号通路（lipopolysaccharide-mediated signaling pathway）、响应DNA损伤的内在凋亡信号通路（intrinsic apoptotic signaling pathway in response to DNA damage）、磷脂酰肌醇信号通路（phospholipase C-activating G-protein coupled receptor signaling pathway）。GO-CC主要包括高尔基体（Golgi apparatus）、质膜的组成部分（integral component of plasma membrane）。GO-MF主要包括血红素结合（heme binding）、前列腺素内过氧化物合酶活性（prostaglandin-endoperoxide synthase activity）。KEGG信号通路以P0.05为条件，筛选Top15的信号通路见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.F004图4GO富集分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.F005图5KEGG通路分析由图5可知，主要包括NOD-like受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、癌症通路（Pathways in cancer）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、VEGF信号通路（VEGF signaling pathway）、乙型肝炎（Hepatitis B）等信号通路。2.6汉黄芩素-核心靶点分子对接CASP3、IL-6、MAPK14、TNF在PPI网络中占有重要位置，且均是汉黄芩素的对应靶点。因此，将靶点蛋白与汉黄芩素进行对接，结合能越低，表示核心靶点与化合物的结合越稳定。核心靶点对接结合能见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.T005表5核心靶点对接结合能靶点结合能/(kJ/mol)CASP 3-28.21TNF-27.54MAPK 14-31.31IL-6-30.10由表5可知，对接结果显示结合能均小于-20.93 kJ/mol，表示汉黄芩素与核心靶点的结合活性较好，汉黄芩素与核心靶点分子对接可视化见图6。图6汉黄芩素与核心靶点分子对接可视化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.F6a1（a）汉黄芩素与CASP3对接图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.F6a2（b）汉黄芩素与IL6对接图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.F6a3（c）汉黄芩素与MAPK14对接图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.016.F6a4（d）汉黄芩素与TNF对接图3讨论本试验中，苍术通过有效活性成分汉黄芩素调控高尔基体、NOD-like受体、癌症通路、TNF等信号通路的CASP 3、IL 6、MAPK 14、TNF等关键靶点发挥作用，降低炎症因子水平，保护肠道，从而治疗仔猪腹泻。于艳等[12]发现，经过麸炒的茅苍术能够明显降低血清和胃组织中IL-6、IL-8、TNF-α和PGE2的含量，同时下调胃组织中IL-8和TNF-α mRNA的表达。麸炒后的茅苍术对乙酸致胃溃疡大鼠的抗炎作用较麸炒前显著增强。王利军等[13]将发酵北苍术添加到断奶仔猪饲料中，结果发现，发酵北苍术具有刺激动物自身产生免疫因子，从而提高动物免疫功能的作用。张玉千[14]使用发酵中药渣饲喂仔猪，结果发现，添加发酵中药渣可以降低仔猪腹泻率，提高仔猪血清中IgA和IgM含量。王喆等[15]将苍术挥发油作用于大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母，结果表明，经蒸馏提取的苍术挥发油对以上3种菌均具有抑菌效果，证明苍术良好的抗炎、抗菌、免疫调节等药理作用。4结论本试验中，苍术治疗仔猪腹泻的主要活性成分为3β-乙酰氧基苍术酮和汉黄芩素，作用靶点有23个，包括MAPK14、NOS2、PTGS2、TNF、IL-6、CCND1、NOS3、ESR1在内14个核心靶点。汉黄芩素与度值较高的CASP3、TNF、MAPK14、IL-6均能够较好地结合。利用潜在作用靶点进行GO和KEGG富集分析，筛选得到GO条目75个，KEGG信号通路50条。因此，苍术通过有效活性成分3β-乙酰氧基苍术酮和汉黄芩素调控NOD-like受体、癌症通路、TNF等信号通路上关键靶点，降低炎症因子水平，保护肠道，从而治疗仔猪腹泻。