植物蛋白质原料含量高、营养丰富,能够不同程度刺激动物生长和繁殖。目前,植物蛋白资源短缺,影响饲料工业的持续发展[1]。由于饲料玉米豆粕减量化替代方案的提出,使植物资源饲料化成为研究热点。菜籽粕(Rapeseed meal,RSM)是油菜籽榨油的副产物,粗蛋白含量达32%~40%[2],赖氨酸含量与大豆蛋白接近,蛋氨酸含量高于大豆蛋白,是动物饲料蛋白的良好来源[3-4]。但菜籽粕中植物次生代谢物硫代葡萄糖苷(又称硫甙)[5]是影响菜籽粕利用的主要抗营养因子之一。硫甙本身具有毒性,在酶的作用下,硫甙可降解为硫氰酸盐[6]。硫氰酸盐会影响动物适口性,过量使用会引发机体恶心、呕吐、腹泻和器官衰竭等[7]。研究表明,饲喂十字花科植物能够引起生乳中硫氰酸根含量显著上升[8],使植物资源在动物饲料中的应用受到限制[9-10]。因此,通过测定硫氰酸盐含量可以反映抗营养因子硫甙的含量,明确菜籽粕中抗营养因子水平。目前,硫氰酸盐的检测方法种类包括显色分光光度计法[11]、高效液相色谱法[12]、气相色谱法[13]、扫描拉曼光谱法[14]、离子色谱法[15-16]等,离子色谱法以灵敏度高、分离效果好、前处理简单等优点被广泛使用。硫氰酸盐的检测分析研究集中在乳制品,在植物饲料原料,如菜籽粕中硫氰酸盐含量分析报道较少。本研究建立饲料原料菜籽粕中硫氰酸盐分析方法,对完善硫氰酸盐的检测方法体系、发挥菜籽粕等植物蛋白资源在畜禽养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1材料、试剂与仪器菜籽粕购自北京某饲料生产企业。优级纯硫氰酸钠(NaSCN)(Sigma公司)、电阻率18.2 MΩ·cm超纯水(德国默克密理博Milli-Q)、3 mL 0.2 μm滤膜(EMR-Lipid:Agilent Technologies)。Dionex ICS-1100(USA)离子色谱仪(抑制器、电导检测器、Dionex EGC Ⅲ KOH 型淋洗液自动发生装置)、KS 300 EI数控超声清洗仪、ME 204/02电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、DMT-2500多管漩涡混合仪(杭州米欧仪器有限公司);FW-100高速万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器有限公司);色谱纯乙腈(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。1.2分析条件色谱柱:IonPac AS-16型色谱柱(4 mm×250 mm)和IonPac AG-16型保护柱(4 mm×50 mm)。抑制器:AERS 500,电流161 mA。淋洗液:45~65 mmol/L KOH溶液,梯度淋洗。色谱柱淋洗梯度条件见表1。流速1.0 mL/min,柱温:30 ℃,进样量:10 μL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.026.T001表1色谱柱梯度淋洗条件时间/min0~1313.1~18.018.1~23.0OH-浓度/(mmol/L)4565451.3样品前处理取2 g(精确至0.01 g)样品,加入4 mL乙腈,加水定容至20 mL,涡旋混匀,超声提取30 min,静置5 min,取适量提取液,过EMR-Lipid柱,取1 mL滤液水定容至10 mL,过0.22 μm滤膜,上机。1.4硫氰酸盐标准溶液配制将硫氰酸钠(NaSCN)标准品于烘箱内烘干2 h,准确称取干燥的NaSCN 0.139 7 g,采用水定容至100 mL容量瓶中,配制浓度为1 000 mg/L的标准储备液,0~4 ℃保存。移取储备液1 mL,水定容至100 mL,混匀,配制浓度为10 mg/L的标准中间液,0~4 ℃保存。分别移取适量标准中间液,梯度稀释配制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的标准溶液,现用现配。1.5数据统计与分析试验数据主要采用Excel进行处理,并绘制曲线。2结果与分析2.1样品前处理OnGuard RP和EMR-Lipid两种固相萃取柱均对蛋白质、脂类具有较高的选择吸附性。EMR-Lipid在样品处理效率具有明显优势。前处理方法对比是否进行离心操作,两种前处理方法硫氰酸根离子回收率见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.026.F001图1两种前处理方法硫氰酸根离子回收率注:方法一为离心;方法二未离心。由图1可知,离心后硫氰酸根离子回收率效果较差,可能因为离心处理后上层提取液中待测物分布不均,导致回收率低。在对蔬菜中硫氰酸盐含量测定的研究中[17],采用20 min超声提取具有较好的回收率。在对奶粉中硫氰酸根测定中采用10 min超声提取具有较好的回收率[18],鉴于饲料原料菜籽粕较蔬菜和奶粉基质较为复杂,延长超声提取时间至30 min,可以获得较好回收率。2.2色谱柱的选择硫氰酸根离子是易极化和疏水性的阴离子。AS11色谱柱和AS19色谱柱在测定硫氰酸根离子时,出现峰形拖尾严重、干扰峰多现象,检测时间长。硫氰酸根离子的离子色谱图见图2。由图2可知,AS16分析柱分析硫氰酸根离子的分离效果较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.026.F002图2硫氰酸根离子色谱图2.3线性范围、相关系数、检出限结果采用外标法定量,以硫氰酸根离子质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得到硫氰酸根离子在0.1~5 mg/L内与峰面积呈线性关系,线性方程分别为Y=0.216x-0.009,R2=0.999。硫氰酸根离子标准曲线见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.026.F003图3硫氰酸根离子标准曲线由图3可知,线性关系良好,满足分析要求。2.4重复性及回收率结果取浓度为5 mg/kg的标准溶液,重复测定6次,测定见图4。由图4可知,其电导检测器测定结果的RSD值为0.191%,RSD值均小于2.0%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.026.F004图4硫氰酸根离子精密度测定(n=6)硫氰酸根离子精密度测定见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.026.T002表2硫氰酸根离子精密度测定项目硫氰酸根含量/(mg/kg)RSD/%保留时间/minRSD/%硫氰酸根离子5.053 90.2267.2370.0915.068 47.2235.059 97.2245.040 97.2305.049 67.2245.038 37.218由表2可知,利用离子色谱法测定菜籽粕中SCN-含量的精密度较高,满足分析要求。对菜籽粕中SCN-进行加标回收分析,在菜籽粕中添加0.2与0.3 mg/g硫氰酸跟标准品,样品加标回收率见表3,样品中硫氰酸根离子色谱图见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.026.T003表3样品加标回收率(n=6)项目添加浓度0.2 mg/g添加浓度0.3 mg/g回收率平均值RSD回收率平均值RSD硫氰酸根离子回收率85.086.12.8101.2102.42.986.699.484.9107.490.2104.687.399.682.8102.3%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.026.F005图5样品中硫氰酸盐色谱图由表3、图5可知,所得平均加标回收率分别为86.1%与102.4%(n=6)。本方法测定菜籽粕中SCN-含量回收率较好,说明该方法检测结果准确。2.5样品硫氰酸盐含量分析(见表4)不同饲料生产企业采集6份不同来源菜籽粕进行分析。根据文献报道对比目前蔬菜、牛奶中的硫氰酸盐含量[19-20],不同种类硫氰酸盐含量对比见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.026.T004表4样品中硫氰酸盐含量(n=2)项目S1S2S3S4S5S6SCN-104.93103.7099.87107.41117.20115.74mg/kg10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.09.026.T005表5不同种类硫氰酸盐含量对比项目萝卜干生乳菜籽粕SCN-32.356.67104.93mg/kg由表4、表5可知,菜籽粕中的浓度较高,替代豆粕使用时,尤其在奶牛饲料中的安全问题不容忽视。3结论本试验建立在菜籽粕中硫氰酸根离子的离子色谱分析方法之上,样品前处理简单,重复性良好,在0.1~5.0 mg/kg浓度范围内具有良好的线性范围,添加回收率满足方法学要求,可以作为饲料植物蛋白原料菜籽粕中硫氰酸根的检测方法。
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