猪血凝性脑脊髓炎病毒（porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV）是一种高度嗜神经的病毒，也是常见危害猪的冠状病毒之一。PHEV多感染4周龄以下的仔猪，由于病毒毒株的毒力和动物的易感性不同，猪血凝性脑脊髓炎（PHE）可根据临床表现分为神经型和呕吐消耗型。呕吐消耗型PHE以呕吐、便秘和食欲减退为主要特征，患病猪快速死亡或慢性衰弱；神经型PHE则表现为间歇性呕吐、便秘，口渴喜饮，咽喉肌麻痹，全身肌肉震颤，四肢呈游泳状，角弓反张，眼球震颤、失明等，病死率可达100％。PHEV是首批得到分离和鉴定的猪冠状病毒之一，于1962年在加拿大首次从仔猪脑中分离得到[1]，之后欧洲、亚洲和北美的一些主要养猪国家也报告了此病毒的感染[2-3]；近年来，PHEV的发生呈上升趋势，我国吉林、辽宁、山东等地均有报道[4]。除了部分发病猪场，辽宁许多猪场PHEV仍处于隐性感染，对养猪企业造成了一定的安全隐患。因此，确定辽宁地区流行毒株，明确其发病特征和变异情况，对于该病的早期检测预警和保证养猪业的健康发展及猪肉食品安全具有重要意义。本研究以辽宁辽南地区某发病猪场为研究对象，对疑似PHE发病猪进行了病原鉴定和变异分析，同时通过病理学观察总结其病理变化特征。为明确辽宁地区PHEV传播来源，制定有针对性的防控措施提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样本来源鞍山市台安县某猪场，饲养500头存栏母猪，仔猪和保育猪约3 500头。3月有500头10日龄左右小猪陆续发病，主要表现精神沉郁、肌肉震颤、抽搐、角弓反张或四肢呈游泳状、眼球震颤、不能哺乳等；采用抗生素等药物进行治疗无效果。2周内大部分发病仔猪陆续死亡，病死率高达90％；少数发病仔猪病程拖延，表现为衰弱、被毛粗乱、皮肤发绀，呕吐、便秘，共济失调、后肢麻痹等症状。本试验选取典型发病仔猪进行病理剖检，并无菌采集脑、肝、脾、肾、肺、心、颌下淋巴结等组织，10%福尔马林溶液固定，应用于制作组织切片；无菌采集的肝脏、肺脏、脾脏、淋巴结等病料冷藏保存，应用于细菌学检测；上述病料均-80℃保存，应用于核酸检测和病毒培养。1.1.2主要试剂2×San Taq Master Mix、DL2000 DNA Marker、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（北京天根生物科技有限公司）；反转录试剂盒（成都福际生物技术有限公司）、细菌基因组DNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）。常见猪病病原核酸检测引物由锦州医科大学兽医学科实验室设计保存。1.1.3主要仪器凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、PCR基因扩增仪（Blue Marlin公司）等。1.2试验方法1.2.1分子生物学检测与分析1.2.1.1引物的设计与合成采用Oligo、Primer6.0软件设计PHEV的S1基因引物，由上海生工生物公司合成，引物序列见表1；其他病毒和细菌核酸检测引物由本校兽医学科实验室提供。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.005.T001表1引物序列Tab.1Primer sequence名称引物序列（5'→3'）片段长度/bpPHEV-FGGATCCATGTTTTTTATACTTTTAATCACCC885PHEV-RCTCGAGCATAAAATCACTAGCACAATCAAC1.2.1.2反转录病料在灭菌研钵中以剪刀剪碎，采用PBS进行10倍稀释，反复冻融3次，3 000 r/min离心10 min，取上清液加入双抗，青、链霉素终浓度达100 U/mL，0.22 μm滤膜过滤后提取病毒DNA，操作步骤按照反转录试剂盒说明书进行。合成体系为：2×RT Easy TM Mix 5 μL、RNA 5 μL。合成程序为：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。1.2.1.3PCR扩增反应以步骤1.3.1.2中合成的cDNA为模板，进行RT-PCR。反应体系为：2×San Taq Master Mix 5 μL、PHEV-F 1 μL、PHEV-R 1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 11 μL。反应程序为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，52 ℃ 34 s，共计30个循环。程序结束后，将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察目的条带。1.2.1.4序列比对分析应用RT-PCR对病料进行扩增得到的符合目的片段产物送上海生工生物公司测序。测序结果在NCBI上Blast在线对比软件进行测序比对，确定为PHEV，并命名为PHEV-LN202001毒株。挑选出23株同源性较高的序列，结果采用DNAMAN、Megalign、MAGA6.06等软件进行进化树、变异性分析。1.2.2细菌性检查对阳性病料样品应用常规细菌学检测方法进行检测，以明确阳性病料是否混合细菌感染，猪瘟、伪狂犬等病毒和细菌检测引物由本实验室提供。1.2.3病理学检查对核酸检测PHEV阳性，其他病毒和细菌阴性的病例进行病理剖检变化观察，应用病理组织学技术，脑、肺、肝、肾、心脏、淋巴结和肠等器官。采用10%福尔马林固定，制成病理组织切片，显微图像分析系统进行病理组织学观察并采集图片，记录患病猪的病理变化。2结果与分析2.1分子生物学检测和分析结果2.1.1PHEV核酸检测结果（见图1）由图1可知，通过PCR扩增及凝胶电泳得到的引物条带产物大小为885 bp，与目的条带相符。随即将产物稀释10倍作为模板，做PCR得到大量产物送至上海生工生物公司测序，将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，确定为猪血凝性脑脊髓炎病毒（暂命名为PHEV-LN202001）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.005.F001图1PHEV核酸检测结果Fig.1PHEV nucleic acid test result注 ： M为DL2000 Marker，1为样品模板，2为阳性对照，3为阴性对照。猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪链球菌等类症病原检测结果均显示阴性。2.1.2PHEV S1基因检测与遗传变异分析（见图2、图3）由图2、图3可知，应用S1引物扩增得到885 bp目的条带，PCR产物送至上海生工生物公司测序。得到的序列经Megalign与DNAman软件，与Genbank上所上传的代表毒株核苷酸序列比对，经遗传进化树分析。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.005.F002图2PHEV-LN202001毒株与其他已知代表株核苷酸序列同源性分析Fig.2Nucleotide homology analysis between PHEV-LN202001 strain and other known representative strainsXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.005.F003图3PHEV-LN202001毒株与其他已知代表株基因序列遗传进化树Fig.3Genetic evolution tree of PHEV-LN202001 and other known representative strains结果发现，PHEV-LN202001毒株与传统毒株亲缘距离较远，与长春CC14等国内毒株遗传距离较远，但与美国15TOSU24992（KY419108）株可分为同一个分支。结果表明，辽宁毒株不是国内其他地区输入，而是直接来自国外输入。同源性分析结果显示，PHEV-LN-202001毒株与已知国内外毒株整体同源性达73.52%，表明该毒株存在较大变异。2.2病理学检查结果2.2.1病理剖检变化观察结果（见图4）由图4可知，患病猪四肢腋下、肚脐、胸部均有斑状出血；脑膜和脑实质充血和出血斑点；胃肠黏膜肿胀充气、附有黏液；颌下、腹股沟等淋巴结肿胀、出血；脾脏出血灶；心冠状脂肪和心外膜有散在的出血点；肝脏和肾脏色泽变淡；肺脏表面可见出血斑。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.005.F004图4PHEV感染病猪典型临床及剖检变化Fig.4Typical clinical and necropsy changes of PHEV infected pigs2.2.2病理组织学变化观察结果（见图5）由图5可知，根据组织切片观察可见脑血管扩张充血，血管周围淋巴细胞、单核细胞包围，红细胞渗出，神经胶质细胞增生，神经元变性坏死；淋巴结和脾脏广泛出血，淋巴细胞和网状细胞减少；小肠黏膜上皮及固有层腺体腺上皮细胞脱落，杯状细胞增多，间质充血出血和淋巴细胞浸润；肾脏间质充血出血，肾小管上皮细胞变性、肿胀，官腔闭塞，结构紊乱。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.005.F005图5PHEV感染病理组织学变化Fig.5Histopathological changes of PHEV infection3讨论PHEV是已知影响猪的6种冠状病毒之一（其他5种分别为传染性胃肠炎冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪Delta冠状病毒、猪呼吸道冠状病毒、BAT HKU2样猪肠道α冠状病毒），属冠状病毒科、冠状病毒亚科、乙型冠状病毒属，猪是该病毒的唯一自然宿主。PHEV有5种结构蛋白[5-8]，其中纤突蛋白（S蛋白，180~200 kDa）属于1型糖蛋白，主导病毒侵入和传播的作用。S蛋白是决定病毒宿主和组织特异性的关键蛋白质，S1区包含许多抗原表位，与机体的免疫反应密切相关。S蛋白很大程度地决定着病毒的趋向性和致病性，是该病毒最易发生变异的蛋白基因。目前我国对PHEV流行毒株进行分离鉴定和遗传变异分析的相关研究不多。2016年，Li等[9]分离到一株野毒株，对其进行了鉴定，并命名为PHEV-CC14；对其进行遗传发育分析和测序，结果表明，在GenBank中该毒株与已有的其他PHEV毒株有超过95%的核苷酸同源性；系统发育分析证明，该野生株与HEV-JT06株为同一个亚类。PHEV在全球猪业中报道的临床流行率较低[10]。目前，已有多种实验室诊断方法应用于PHEV的检测[11-12]，但操作复杂、反应时间长、无法应用于大规模样品检测。2018年，舒婧妍[13]研制的间接ELISA抗体试剂盒方法，可应用于大规模样品检测，为血清学调查提供了参考。2019年，Wang等[14]建立了应用于检测和区分PHEV 1、2和3型的三重实时荧光RT-PCR方法，为临床标本中检测和区分PHEV的3种基因型提供了一种快速、灵敏的方法。2020年，林野等[15]以重组蛋白N为包被抗原，采用建立的ELISA方法对辽宁部分地区血清样品进行检测，结果显示，该地区阳性率达53.74%（79/147）；研究结论为PHEV感染的监测和高效防控提供了一定参考。PHEV是一种高度嗜神经的病毒。临床上，PHE主要病理变化呈非化脓性脑炎病变，如血管袖套、神经胶质细胞增生、神经元变质等；其他器官剖检变化各地报道则各有差异，包括急性病猪扁桃体的隐窝上皮变性和淋巴细胞浸润，支气管间质性肺炎，肌肉结缔组织不同程度的水肿，胃肠卡他性炎，肺充血、瘀血，肾小管上皮细胞发生颗粒变性和坏死等。本研究对辽宁毒株感染病例通过剖检观察，主要剖检变化表现为四肢腋下、肚脐、胸部出现斑状出血，脑膜严重出血；结肠的肠黏膜出血，颌下、腹股沟淋巴结肿胀、出血，心冠出现散在且大小不等的出血点，肝脏出现灰白色坏死灶，脾脏有梗死灶；肾脏包膜不易剥离，强制剥离容易形成溃疡灶；肺脏表面有大小不等灰白色坏死灶和出血斑。病理组织学变化为淋巴结广泛出血，淋巴细胞和网状细胞减少；肾脏间质充血出血，肾小管上皮细胞变性、肿胀，官腔闭塞，结构紊乱；小肠黏膜上皮及固有层腺体腺上皮细胞脱落而不完整，杯状细胞增多，间质充血出血和淋巴细胞浸润；脑血管扩张充血，血管周围淋巴细胞、单核细胞包围，神经胶质细胞增生，神经元变性坏死。上述结果表明，辽宁毒株侵入器官组织更加广泛，出血和变质变化更加突出，显示其致病力更强，与临床发病率、病死率高、病程更长的表现一致。7日龄以内的PHEV病例多以神经型为主，最早的症状是呕吐，接着发生便秘，口渴喜饮，之后咽喉肌麻痹，不能吞咽，全身肌肉震颤，常呈犬坐姿势；虚弱、不能站立，四肢呈游泳状，角弓反张、眼球震颤、失明等。部分患病猪在1~2周内死亡，大多数转为慢性，存活数周，但最后由于饥饿或继发症而死亡。自发病起至结束，通常2~3周。青年猪多为呕吐消耗型病毒病，以呕吐、便秘和食欲减退为特征。消耗阶段可能持续1~6周，直至患病猪因饥饿而死亡。本病的病死率极高，幸存者成为永久性僵猪。本起辽宁毒株感染病例临床症状主要为抽搐和震颤，其他系统症状轻重不一，可能与病变器官多样化有关。近年来，PHEV感染呈现上升趋势，而且有部分场群仍处于隐性感染；一旦暴发，临床上尚无疫苗或任何治疗措施，往往可造成严重的损失。因此，必须高度重视PHEV的监测和研究，及时查明感染流行范围，确定流行毒株种类和来源，开发检测方法和疫苗，建立有针对性的诊断和防控措施，对于该病的早期检测预警和保证养猪业的健康发展及猪肉的食品安全具有重要意义。4结论对辽宁流行毒株PHEV-LN202001的S1基因序列经遗传进化树分析，发现此毒株与传统毒株亲缘距离较远，与长春CC14等国内毒株遗传距离较远，而与美国15TOSU24992（KY419108）株属同一个分支。结果表明，辽宁毒株PHEV-LN202001不是国内其他地区输入，而是由国外输入。同源性分析显示，该毒株与已知国内外毒株整体同源性达73.52%，说明该毒株有较大变异。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.05.005.F006